Bedeutung zellulärer Anheftungsfaktoren für die Ausbreitung des humanen Immundefizienz-Virus

The envelope protein (Env) of human immunodeficiency virus (HIV) mediates infectious entry into target cells. The interaction of Env with the CD4 receptor and a chemokine receptor is essential for infection, while binding to so-called attachment factors is dispensable. However, attachment factor engagement can profoundly augment infection efficiency. The attachment factor DC-SIGN is expressed on submucosal dendritic cells and it has been postulated that binding of HIV to DC-SIGN on dendritic cells might promote sexual transmission of HIV. However, more recent work suggests that dendritic cells can also bind to HIV in a DC-SIGN-independent manner and that DC-SIGN-negative cells can promote HIV infection of adjacent cells (trans-infection). Furthermore, it has been shown that polymorphisms in the DC-SIGN gene influence the risk of HIV infection upon parenteral, but not mucosal HIV transmission. This observation indicates that DC-SIGN on mucosal dendritic cells might not be involved in sexual transmission of HIV, whereas hitherto unknown DC-SIGN-positive cells might augment dissemination of the virus after its entry into the bloodstream. Therefore, the objective of this work was to identify new DC-SIGN-positive cells and new HIV attachment factors, and to determine their impact on HIV dissemination. In the present study the cellular surface protein CLEC-2 could be identified as a new HIV attachment factor. It could be shown that CLEC-2 is expressed on platelets and megakaryocytes, and that platelets mediate HIV trans-infection of T-cells in a partly CLEC-2-dependent manner. Furthermore, it could be demonstrated that platelets also express DC-SIGN and that this lectin is mainly responsible for HIV binding to platelets. Evidence was obtained that CLEC-2, in contrast to DC-SIGN, does not interact with the HIV Env protein but with a cellular factor incorporated into the viral membrane upon virus release. Expression analysis and siRNA-mediated knock-down demonstrated that this cellular factor is podoplanin, a mucin-type protein found to be expressed on 293T cells, which were routinely used for virus production. However, the observation that viruses generated in podoplanin-negative cells still interacted with CLEC-2 suggested that either endogenous podoplanin expression is induced during HIV infection or additional CLEC-2 ligands are expressed on HIV target cells. In summary, it could be demonstrated that platelets bind and transmit HIV to T-cells via DC-SIGN and CLEC-2, a process that might aid HIV dissemination in infected individuals.Das Hüllprotein (Env) des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) vermittelt den infektiösen Eintritt in Zielzellen. Die Interaktion von Env mit dem CD4-Rezeptor und einem Chemokinrezeptor ist für die Infektion essentiell. Die Bindung an sogenannte Anheftungsfaktoren ist dagegen für den infektiösen Eintritt nicht erforderlich, sie kann jedoch die Infektionseffizienz stark erhöhen. Der Anheftungsfaktor DC-SIGN wird auf submukosalen dendritischen Zellen exprimiert und verstärkt die HIV-Infektion benachbarter T-Zellen (Trans-Infektion). Es wurde initial postuliert, dass die DC-SIGN-abhängige Bindung von HIV an dendritische Zellen die sexuelle Übertragung des Virus fördert. Neuere Arbeiten zeigen jedoch, dass neben DC-SIGN weitere, zum Teil unbekannte Faktoren die effiziente Anheftung von HIV an dendritische Zellen und Zelllinien vermitteln. Weiterhin wurde dokumentiert, dass Polymorphismen im DC-SIGN-Gen das Risiko einer HIV-Infektion bei parenteraler, nicht jedoch bei mukosaler Übertragung beeinflussen. Diese Beobachtung kann dahingehend interpretiert werden, dass DC-SIGN-exprimierende dendritische Zellen in den Schleimhäuten für die sexuelle Übertragung von HIV nicht wichtig sind, während bis dato unbekannte DC-SIGN-positive Zellen nach dem Eindringen des Virus in die Blutbahn dessen Ausbreitung fördern. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, weitere DC-SIGN-positive Zelltypen bzw. weitere HIV-Anheftungsfaktoren zu identifizieren und deren Bedeutung für die Disseminierung des Virus zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte CLEC-2 als neuer HIV-Anheftungsfaktor identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass CLEC-2 auf Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert wird und dass Thrombozyten in einer zum Teil CLEC-2-abhängigen Weise die HIV-1-Trans-Infektion von CD4-positiven Zielzellen fördern. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Thrombozyten DC-SIGN exprimieren und dass DC-SIGN wesentlich zur HIV-Interaktion mit Thrombozyten beiträgt. Es ergaben sich Hinweise, dass CLEC-2 im Gegensatz zu DC-SIGN nicht mit dem HIV-Hüllprotein interagiert, sondern mit einem zellulären Faktor, der im Verlauf der Virusfreisetzung in die virale Hüllmembran inkorporiert wird. Expressionsanalysen und der Einsatz von siRNAs lieferten Hinweise darauf, dass es sich bei dem zellulären Faktor um Podoplanin handelt. Podoplanin ist ein Muzin-ähnliches Protein, das unter anderem auf 293T Zellen exprimiert wird, welche in der vorliegenden Arbeit für die Herstellung von HIV eingesetzt wurden. Die Beobachtung, dass auch Viren, die in Podoplanin-negativen Zellen generiert wurden, mit CLEC-2 interagierten, legt allerdings nahe, dass entweder im Verlauf der HIV-Infektion die Expression von Podoplanin induziert wird oder weitere CLEC-2-Liganden auf HIV-permissiven Zellen exprimiert werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Thrombozyten HIV mittels DC-SIGN und CLEC-2 binden und an T-Zellen übertragen; ein Prozess, der möglicherweise zur Ausbreitung von HIV in infizierten Personen beiträgt

Lack of Detection of Xenotropic Murine Leukemia Virus-Related Virus in HIV-1 Lymphoma Patients

Xenotropic murine leukemia virus-related virus (XMRV) is a gammaretrovirus reported to be associated with human prostate cancer and chronic fatigue syndrome. Since retroviruses cause various cancers, and XMRV replication might be facilitated by HIV-1 co-infection, we asked whether certain patients with HIV-associated lymphomas are infected with XMRV. Analysis of PMBCs and plasma from 26 patients failed to detect XMRV by PCR, ELISA, or Western blot, suggesting a lack of association between XMRV and AIDS-associated lymphomas

Role of cellular attachment factors in HIV dissemination

Das Hüllprotein (Env) des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) vermittelt den infektiösen Eintritt in Zielzellen. Die Interaktion von Env mit dem CD4-Rezeptor und einem Chemokinrezeptor ist für die Infektion essentiell. Die Bindung an sogenannte Anheftungsfaktoren ist dagegen für den infektiösen Eintritt nicht erforderlich, sie kann jedoch die Infektionseffizienz stark erhöhen. Der Anheftungsfaktor DC-SIGN wird auf submukosalen dendritischen Zellen exprimiert und verstärkt die HIV-Infektion benachbarter T-Zellen (Trans-Infektion). Es wurde initial postuliert, dass die DC-SIGN-abhängige Bindung von HIV an dendritische Zellen die sexuelle Übertragung des Virus fördert. Neuere Arbeiten zeigen jedoch, dass neben DC-SIGN weitere, zum Teil unbekannte Faktoren die effiziente Anheftung von HIV an dendritische Zellen und Zelllinien vermitteln. Weiterhin wurde dokumentiert, dass Polymorphismen im DC-SIGN-Gen das Risiko einer HIV-Infektion bei parenteraler, nicht jedoch bei mukosaler Übertragung beeinflussen. Diese Beobachtung kann dahingehend interpretiert werden, dass DC-SIGN-exprimierende dendritische Zellen in den Schleimhäuten für die sexuelle Übertragung von HIV nicht wichtig sind, während bis dato unbekannte DC-SIGN-positive Zellen nach dem Eindringen des Virus in die Blutbahn dessen Ausbreitung fördern. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, weitere DC-SIGN-positive Zelltypen bzw. weitere HIV-Anheftungsfaktoren zu identifizieren und deren Bedeutung für die Disseminierung des Virus zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte CLEC-2 als neuer HIV-Anheftungsfaktor identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass CLEC-2 auf Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert wird und dass Thrombozyten in einer zum Teil CLEC-2-abhängigen Weise die HIV-1-Trans-Infektion von CD4-positiven Zielzellen fördern. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Thrombozyten DC-SIGN exprimieren und dass DC-SIGN wesentlich zur HIV-Interaktion mit Thrombozyten beiträgt. Es ergaben sich Hinweise, dass CLEC-2 im Gegensatz zu DC-SIGN nicht mit dem HIV-Hüllprotein interagiert, sondern mit einem zellulären Faktor, der im Verlauf der Virusfreisetzung in die virale Hüllmembran inkorporiert wird. Expressionsanalysen und der Einsatz von siRNAs lieferten Hinweise darauf, dass es sich bei dem zellulären Faktor um Podoplanin handelt. Podoplanin ist ein Muzin-ähnliches Protein, das unter anderem auf 293T Zellen exprimiert wird, welche in der vorliegenden Arbeit für die Herstellung von HIV eingesetzt wurden. Die Beobachtung, dass auch Viren, die in Podoplanin-negativen Zellen generiert wurden, mit CLEC-2 interagierten, legt allerdings nahe, dass entweder im Verlauf der HIV-Infektion die Expression von Podoplanin induziert wird oder weitere CLEC-2-Liganden auf HIV-permissiven Zellen exprimiert werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Thrombozyten HIV mittels DC-SIGN und CLEC-2 binden und an T-Zellen übertragen; ein Prozess, der möglicherweise zur Ausbreitung von HIV in infizierten Personen beiträgt.The envelope protein (Env) of human immunodeficiency virus (HIV) mediates infectious entry into target cells. The interaction of Env with the CD4 receptor and a chemokine receptor is essential for infection, while binding to so-called attachment factors is dispensable. However, attachment factor engagement can profoundly augment infection efficiency. The attachment factor DC-SIGN is expressed on submucosal dendritic cells and it has been postulated that binding of HIV to DC-SIGN on dendritic cells might promote sexual transmission of HIV. However, more recent work suggests that dendritic cells can also bind to HIV in a DC-SIGN-independent manner and that DC-SIGN-negative cells can promote HIV infection of adjacent cells (trans-infection). Furthermore, it has been shown that polymorphisms in the DC-SIGN gene influence the risk of HIV infection upon parenteral, but not mucosal HIV transmission. This observation indicates that DC-SIGN on mucosal dendritic cells might not be involved in sexual transmission of HIV, whereas hitherto unknown DC-SIGN-positive cells might augment dissemination of the virus after its entry into the bloodstream. Therefore, the objective of this work was to identify new DC-SIGN-positive cells and new HIV attachment factors, and to determine their impact on HIV dissemination. In the present study the cellular surface protein CLEC-2 could be identified as a new HIV attachment factor. It could be shown that CLEC-2 is expressed on platelets and megakaryocytes, and that platelets mediate HIV trans-infection of T-cells in a partly CLEC-2-dependent manner. Furthermore, it could be demonstrated that platelets also express DC-SIGN and that this lectin is mainly responsible for HIV binding to platelets. Evidence was obtained that CLEC-2, in contrast to DC-SIGN, does not interact with the HIV Env protein but with a cellular factor incorporated into the viral membrane upon virus release. Expression analysis and siRNA-mediated knock-down demonstrated that this cellular factor is podoplanin, a mucin-type protein found to be expressed on 293T cells, which were routinely used for virus production. However, the observation that viruses generated in podoplanin-negative cells still interacted with CLEC-2 suggested that either endogenous podoplanin expression is induced during HIV infection or additional CLEC-2 ligands are expressed on HIV target cells. In summary, it could be demonstrated that platelets bind and transmit HIV to T-cells via DC-SIGN and CLEC-2, a process that might aid HIV dissemination in infected individuals

Droplet-based microfluidics in drug discovery, transcriptomics and high-throughput molecular genetics

Droplet-based microfluidics enables assays to be carried out at very high throughput (up to thousands of samples per second) and enables researchers to work with very limited material, such as primary cells, patient's biopsies or expensive reagents. An additional strength of the technology is the possibility to perform large-scale genotypic or phenotypic screens at the single-cell level. Here we critically review the latest developments in antibody screening, drug discovery and highly multiplexed genomic applications such as targeted genetic workflows, single-cell RNAseq and single-cell ChIPseq. Starting with a comprehensive introduction for non-experts, we pinpoint current limitations, analyze how they might be overcome and give an outlook on exciting future applications

Single-Virus Droplet Microfluidics for High-Throughput Screening of Neutralizing Epitopes on HIV Particles

Analyzing surface epitopes of single HIV particles holds great potential for the development of vaccine candidates. However, existing technologies do not allow corresponding screens at high throughput. We present here a single-virus droplet-based microfluidics platform enabling sorting of millions of HIV-1 particles with >99% efficiency, based on the expression of epitopes recognized by broadly neutralizing antibodies. We show that virus particles displaying these epitopes can be identified, sorted, and analyzed by next-generation sequencing: an approximately 1,900-fold enrichment of viral particles displaying neutralizing epitopes could be obtained in a single sort, thus opening the way for screening diverse virus libraries with optimal antigenic features for HIV vaccine candidates

Modulation of HIV and SIV neutralization sensitivity by DC-SIGN and mannose-binding lectin

The C-type lectin DC-SIGN binds to oligosaccharides on the human and simian immunodeficiency virus (HIV, SIV) envelope glycoproteins and promotes infection of susceptible cells. Here, we show that DC-SIGN recognizes glycans involved in SIV sensitivity to neutralizing antibodies and that binding to DC-SIGN confers neutralization resistance to an otherwise sensitive SIV variant. Moreover, we provide evidence that mannose-binding lectin (MBL) can interfere with HIV-1 neutralization by the carbohydrate-specific antibody 2G12

Inhibition of Xenotropic Murine Leukemia Virus-Related Virus by APOBEC3 Proteins and Antiviral Drugs▿

Xenotropic murine leukemia virus-related virus (XMRV), a gammaretrovirus, has been isolated from human prostate cancer tissue and from activated CD4+ T cells and B cells of patients with chronic fatigue syndrome, suggesting an association between XMRV infection and these two diseases. Since APOBEC3G (A3G) and APOBEC3F (A3F), which are potent inhibitors of murine leukemia virus and Vif-deficient human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), are expressed in human CD4+ T cells and B cells, we sought to determine how XMRV evades suppression of replication by APOBEC3 proteins. We found that expression of A3G, A3F, or murine A3 in virus-producing cells resulted in their virion incorporation, inhibition of XMRV replication, and G-to-A hypermutation of the viral DNA with all three APOBEC3 proteins. Quantitation of A3G and A3F mRNAs indicated that, compared to the human T-cell lines CEM and H9, prostate cell lines LNCaP and DU145 exhibited 50% lower A3F mRNA levels, whereas A3G expression in 22Rv1, LNCaP, and DU145 cells was nearly undetectable. XMRV proviral genomes in LNCaP and DU145 cells were hypermutated at low frequency with mutation patterns consistent with A3F activity. XMRV proviral genomes were extensively hypermutated upon replication in A3G/A3F-positive T cells (CEM and H9), but not in A3G/A3F-negative cells (CEM-SS). We also observed that XMRV replication was susceptible to the nucleoside reverse transcriptase (RT) inhibitors zidovudine (AZT) and tenofovir and the integrase inhibitor raltegravir. In summary, the establishment of XMRV infection in patients may be dependent on infection of A3G/A3F-deficient cells, and cells expressing low levels of A3G/A3F, such as prostate cancer cells, may be ideal producers of infectious XMRV. Furthermore, the anti-HIV-1 drugs AZT, tenofovir, and raltegravir may be useful for treatment of XMRV infection

CD4 Binding Affinity Determines Human Immunodeficiency Virus Type 1-Induced Alpha Interferon Production in Plasmacytoid Dendritic Cells ▿

Plasmacytoid dendritic cells (PDC) are major producers of type I interferons (IFN) in response to human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection. To better define the underlying mechanisms, we studied the magnitude of alpha IFN (IFN-α) induction by recombinant viruses containing changes in the Env protein that impair or disrupt CD4 binding or expressing primary env alleles with differential coreceptor tropism. We found that the CD4 binding affinity but not the viral coreceptor usage is critical for the attachment of autofluorescing HIV-1 to PDC and for subsequent IFN-α induction. Our results illustrate the importance of the gp120-CD4 interaction in determining HIV-1-induced immune stimulation via IFN-α production