Cartographie des nanotubes à effet tunnel in vitro et in vivo : une approche structurelle

Inter-cellular communication has long been thought to be governed by juxta-, endo-, and paracrine signaling, tight junctions, and more recently, exosomes. However, large efforts from our and other groups revealed that Tunneling Nanotubes (TNTs), actin-rich membranousprotrusions that connect the cytoplasm of distant cells and allow the dynamic inter-cellular transport of biological cargo, also provide the infrastructure and machinery for effective cell-tocell communication. Despite significant progress made to unveil TNT-mediated cellcommunication, the characterization of these novel organelles has been limited by unanswered questions that hail from the lack of both molecular and structural information. Exploring these gaps in the field using a series of state-of-the-art tools and novel approaches became the main focus of my dissertation. Specifically, I explored the specific role of actin-regulator complexes in the formation of TNTs connecting neuronal cells. My analyses show that molecular pathways known to be involved in the formation of other membranous protrusions behave differently inthe generation of TNTs. By employing live imaging microscopy, cryo-correlative electron microscopy and tomography approaches, I also studied the nano- architecture of neuronal TNTs.My findings demonstrated that TNTs of neuronal cells are comprised of multiple individual TNTs capable of transporting vesicles and mitochondria. Owing to the difficulties of identifying TNTs in vivo, my work also focused on the implementation of a structural Connectomic approach to detect TNTs in tissue without the need for a TNT-specific marker. My findings indicate that TNTlike structures connect migratory cerebellar granule cells of neonate mice, suggesting that intercellular communication during migratory events in the brain could be mediated by TNT-like processes. Skeletonization of the structures identified provide my findings with geometrical information that can be compared with observations made by corroborative dye-coupling experiments. Taken together, my dissertation work sheds light on the formation and structureof neuronal TNTs in vitro, and novel approaches for the identification of TNTs in vivo.On a longtemps pensé que la communication intercellulaire était régie par la signalisation juxta-, endo- et paracrine, les jonctions serrées et, plus récemment, les exosomes. On a longtemps pensé que la communication intercellulaire était régie par la signalisation juxta-, endo- et paracrine, les jonctions serrées et, plus récemment, les exosomes. Cependant, des efforts importants de notre groupe et d'autres groupes ont révélé que les nanotubes à effet tunnel (TNT), des protubérances membranaires riches en actine qui relient le cytoplasme de cellules distantes et permettent le transport intercellulaire dynamique de cargaisons biologiques, fournissent également l'infrastructure et la machinerie nécessaires à une communication intercellulaire efficace. Malgré les progrès significatifs réalisés pour dévoiler la communication cellulaire médiée par les TNT, la caractérisation de ces nouveaux organites a été limitée par des questions restées sans réponse en raison du manque d'informations moléculaires et structurelles. L'exploration de ces lacunes dans le domaine à l'aide d'une série d'outils de pointe et d'approches nouvelles est devenue l'objectif principal de ma thèse. Plus précisément, j'ai exploré le rôle spécifique des complexes actine-régulateur dans la formation des TNT reliant les cellules neuronales. Mes analyses montrent que les voies moléculaires connues pour être impliquées dans la formation d'autres protubérances membranaires se comportent différemment dans la génération des TNT. En utilisant la microscopie d'imagerie en direct, la microscopie électronique cryocorrélative et des approches de tomographie, j'ai également étudié la nano-architecture des TNT neuronales.Mes résultats ont démontré que les TNT des cellules neuronales sont constituées de multiples TNT individuelles capables de transporter des vésicules et des mitochondries. En raison des difficultés d'identification des TNT in vivo, mon travail s'est également concentré sur la mise en œuvre d'une approche connectomique structurelle pour détecter les TNT dans les tissus sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un marqueur spécifique aux TNT. Mes résultats indiquent que des structures de type TNT relient les cellules granuleuses cérébelleuses migratoires de souris nouveau-nées, ce qui suggère que la communication intercellulaire pendant les événements migratoires dans le cerveau pourrait être médiée par des processus de type TNT. La squelettisation des structures identifiées fournit à mes résultats des informations géométriques qui peuvent être comparées aux observations faites par des expériences corroboratives de couplage de colorants. Dans l'ensemble, mon travail de thèse met en lumière la formation et la structure des TNT neuronales in vitro, ainsi que de nouvelles approches pour l'identification des TNT in vivo

Cartographie des nanotubes à effet tunnel in vitro et in vivo : une approche structurelle

Inter-cellular communication has long been thought to be governed by juxta-, endo-, and paracrine signaling, tight junctions, and more recently, exosomes. However, large efforts from our and other groups revealed that Tunneling Nanotubes (TNTs), actin-rich membranousprotrusions that connect the cytoplasm of distant cells and allow the dynamic inter-cellular transport of biological cargo, also provide the infrastructure and machinery for effective cell-tocell communication. Despite significant progress made to unveil TNT-mediated cellcommunication, the characterization of these novel organelles has been limited by unanswered questions that hail from the lack of both molecular and structural information. Exploring these gaps in the field using a series of state-of-the-art tools and novel approaches became the main focus of my dissertation. Specifically, I explored the specific role of actin-regulator complexes in the formation of TNTs connecting neuronal cells. My analyses show that molecular pathways known to be involved in the formation of other membranous protrusions behave differently inthe generation of TNTs. By employing live imaging microscopy, cryo-correlative electron microscopy and tomography approaches, I also studied the nano- architecture of neuronal TNTs.My findings demonstrated that TNTs of neuronal cells are comprised of multiple individual TNTs capable of transporting vesicles and mitochondria. Owing to the difficulties of identifying TNTs in vivo, my work also focused on the implementation of a structural Connectomic approach to detect TNTs in tissue without the need for a TNT-specific marker. My findings indicate that TNTlike structures connect migratory cerebellar granule cells of neonate mice, suggesting that intercellular communication during migratory events in the brain could be mediated by TNT-like processes. Skeletonization of the structures identified provide my findings with geometrical information that can be compared with observations made by corroborative dye-coupling experiments. Taken together, my dissertation work sheds light on the formation and structureof neuronal TNTs in vitro, and novel approaches for the identification of TNTs in vivo.On a longtemps pensé que la communication intercellulaire était régie par la signalisation juxta-, endo- et paracrine, les jonctions serrées et, plus récemment, les exosomes. On a longtemps pensé que la communication intercellulaire était régie par la signalisation juxta-, endo- et paracrine, les jonctions serrées et, plus récemment, les exosomes. Cependant, des efforts importants de notre groupe et d'autres groupes ont révélé que les nanotubes à effet tunnel (TNT), des protubérances membranaires riches en actine qui relient le cytoplasme de cellules distantes et permettent le transport intercellulaire dynamique de cargaisons biologiques, fournissent également l'infrastructure et la machinerie nécessaires à une communication intercellulaire efficace. Malgré les progrès significatifs réalisés pour dévoiler la communication cellulaire médiée par les TNT, la caractérisation de ces nouveaux organites a été limitée par des questions restées sans réponse en raison du manque d'informations moléculaires et structurelles. L'exploration de ces lacunes dans le domaine à l'aide d'une série d'outils de pointe et d'approches nouvelles est devenue l'objectif principal de ma thèse. Plus précisément, j'ai exploré le rôle spécifique des complexes actine-régulateur dans la formation des TNT reliant les cellules neuronales. Mes analyses montrent que les voies moléculaires connues pour être impliquées dans la formation d'autres protubérances membranaires se comportent différemment dans la génération des TNT. En utilisant la microscopie d'imagerie en direct, la microscopie électronique cryocorrélative et des approches de tomographie, j'ai également étudié la nano-architecture des TNT neuronales.Mes résultats ont démontré que les TNT des cellules neuronales sont constituées de multiples TNT individuelles capables de transporter des vésicules et des mitochondries. En raison des difficultés d'identification des TNT in vivo, mon travail s'est également concentré sur la mise en œuvre d'une approche connectomique structurelle pour détecter les TNT dans les tissus sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un marqueur spécifique aux TNT. Mes résultats indiquent que des structures de type TNT relient les cellules granuleuses cérébelleuses migratoires de souris nouveau-nées, ce qui suggère que la communication intercellulaire pendant les événements migratoires dans le cerveau pourrait être médiée par des processus de type TNT. La squelettisation des structures identifiées fournit à mes résultats des informations géométriques qui peuvent être comparées aux observations faites par des expériences corroboratives de couplage de colorants. Dans l'ensemble, mon travail de thèse met en lumière la formation et la structure des TNT neuronales in vitro, ainsi que de nouvelles approches pour l'identification des TNT in vivo

Cartographie des nanotubes à effet tunnel in vitro et in vivo : une approche structurelle

Inter-cellular communication has long been thought to be governed by juxta-, endo-, and paracrine signaling, tight junctions, and more recently, exosomes. However, large efforts from our and other groups revealed that Tunneling Nanotubes (TNTs), actin-rich membranousprotrusions that connect the cytoplasm of distant cells and allow the dynamic inter-cellular transport of biological cargo, also provide the infrastructure and machinery for effective cell-tocell communication. Despite significant progress made to unveil TNT-mediated cellcommunication, the characterization of these novel organelles has been limited by unanswered questions that hail from the lack of both molecular and structural information. Exploring these gaps in the field using a series of state-of-the-art tools and novel approaches became the main focus of my dissertation. Specifically, I explored the specific role of actin-regulator complexes in the formation of TNTs connecting neuronal cells. My analyses show that molecular pathways known to be involved in the formation of other membranous protrusions behave differently inthe generation of TNTs. By employing live imaging microscopy, cryo-correlative electron microscopy and tomography approaches, I also studied the nano- architecture of neuronal TNTs.My findings demonstrated that TNTs of neuronal cells are comprised of multiple individual TNTs capable of transporting vesicles and mitochondria. Owing to the difficulties of identifying TNTs in vivo, my work also focused on the implementation of a structural Connectomic approach to detect TNTs in tissue without the need for a TNT-specific marker. My findings indicate that TNTlike structures connect migratory cerebellar granule cells of neonate mice, suggesting that intercellular communication during migratory events in the brain could be mediated by TNT-like processes. Skeletonization of the structures identified provide my findings with geometrical information that can be compared with observations made by corroborative dye-coupling experiments. Taken together, my dissertation work sheds light on the formation and structureof neuronal TNTs in vitro, and novel approaches for the identification of TNTs in vivo.On a longtemps pensé que la communication intercellulaire était régie par la signalisation juxta-, endo- et paracrine, les jonctions serrées et, plus récemment, les exosomes. On a longtemps pensé que la communication intercellulaire était régie par la signalisation juxta-, endo- et paracrine, les jonctions serrées et, plus récemment, les exosomes. Cependant, des efforts importants de notre groupe et d'autres groupes ont révélé que les nanotubes à effet tunnel (TNT), des protubérances membranaires riches en actine qui relient le cytoplasme de cellules distantes et permettent le transport intercellulaire dynamique de cargaisons biologiques, fournissent également l'infrastructure et la machinerie nécessaires à une communication intercellulaire efficace. Malgré les progrès significatifs réalisés pour dévoiler la communication cellulaire médiée par les TNT, la caractérisation de ces nouveaux organites a été limitée par des questions restées sans réponse en raison du manque d'informations moléculaires et structurelles. L'exploration de ces lacunes dans le domaine à l'aide d'une série d'outils de pointe et d'approches nouvelles est devenue l'objectif principal de ma thèse. Plus précisément, j'ai exploré le rôle spécifique des complexes actine-régulateur dans la formation des TNT reliant les cellules neuronales. Mes analyses montrent que les voies moléculaires connues pour être impliquées dans la formation d'autres protubérances membranaires se comportent différemment dans la génération des TNT. En utilisant la microscopie d'imagerie en direct, la microscopie électronique cryocorrélative et des approches de tomographie, j'ai également étudié la nano-architecture des TNT neuronales.Mes résultats ont démontré que les TNT des cellules neuronales sont constituées de multiples TNT individuelles capables de transporter des vésicules et des mitochondries. En raison des difficultés d'identification des TNT in vivo, mon travail s'est également concentré sur la mise en œuvre d'une approche connectomique structurelle pour détecter les TNT dans les tissus sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un marqueur spécifique aux TNT. Mes résultats indiquent que des structures de type TNT relient les cellules granuleuses cérébelleuses migratoires de souris nouveau-nées, ce qui suggère que la communication intercellulaire pendant les événements migratoires dans le cerveau pourrait être médiée par des processus de type TNT. La squelettisation des structures identifiées fournit à mes résultats des informations géométriques qui peuvent être comparées aux observations faites par des expériences corroboratives de couplage de colorants. Dans l'ensemble, mon travail de thèse met en lumière la formation et la structure des TNT neuronales in vitro, ainsi que de nouvelles approches pour l'identification des TNT in vivo

Cartographie des nanotubes à effet tunnel in vitro et in vivo : une approche structurelle

Inter-cellular communication has long been thought to be governed by juxta-, endo-, and paracrine signaling, tight junctions, and more recently, exosomes. However, large efforts from our and other groups revealed that Tunneling Nanotubes (TNTs), actin-rich membranousprotrusions that connect the cytoplasm of distant cells and allow the dynamic inter-cellular transport of biological cargo, also provide the infrastructure and machinery for effective cell-tocell communication. Despite significant progress made to unveil TNT-mediated cellcommunication, the characterization of these novel organelles has been limited by unanswered questions that hail from the lack of both molecular and structural information. Exploring these gaps in the field using a series of state-of-the-art tools and novel approaches became the main focus of my dissertation. Specifically, I explored the specific role of actin-regulator complexes in the formation of TNTs connecting neuronal cells. My analyses show that molecular pathways known to be involved in the formation of other membranous protrusions behave differently inthe generation of TNTs. By employing live imaging microscopy, cryo-correlative electron microscopy and tomography approaches, I also studied the nano- architecture of neuronal TNTs.My findings demonstrated that TNTs of neuronal cells are comprised of multiple individual TNTs capable of transporting vesicles and mitochondria. Owing to the difficulties of identifying TNTs in vivo, my work also focused on the implementation of a structural Connectomic approach to detect TNTs in tissue without the need for a TNT-specific marker. My findings indicate that TNTlike structures connect migratory cerebellar granule cells of neonate mice, suggesting that intercellular communication during migratory events in the brain could be mediated by TNT-like processes. Skeletonization of the structures identified provide my findings with geometrical information that can be compared with observations made by corroborative dye-coupling experiments. Taken together, my dissertation work sheds light on the formation and structureof neuronal TNTs in vitro, and novel approaches for the identification of TNTs in vivo.On a longtemps pensé que la communication intercellulaire était régie par la signalisation juxta-, endo- et paracrine, les jonctions serrées et, plus récemment, les exosomes. On a longtemps pensé que la communication intercellulaire était régie par la signalisation juxta-, endo- et paracrine, les jonctions serrées et, plus récemment, les exosomes. Cependant, des efforts importants de notre groupe et d'autres groupes ont révélé que les nanotubes à effet tunnel (TNT), des protubérances membranaires riches en actine qui relient le cytoplasme de cellules distantes et permettent le transport intercellulaire dynamique de cargaisons biologiques, fournissent également l'infrastructure et la machinerie nécessaires à une communication intercellulaire efficace. Malgré les progrès significatifs réalisés pour dévoiler la communication cellulaire médiée par les TNT, la caractérisation de ces nouveaux organites a été limitée par des questions restées sans réponse en raison du manque d'informations moléculaires et structurelles. L'exploration de ces lacunes dans le domaine à l'aide d'une série d'outils de pointe et d'approches nouvelles est devenue l'objectif principal de ma thèse. Plus précisément, j'ai exploré le rôle spécifique des complexes actine-régulateur dans la formation des TNT reliant les cellules neuronales. Mes analyses montrent que les voies moléculaires connues pour être impliquées dans la formation d'autres protubérances membranaires se comportent différemment dans la génération des TNT. En utilisant la microscopie d'imagerie en direct, la microscopie électronique cryocorrélative et des approches de tomographie, j'ai également étudié la nano-architecture des TNT neuronales.Mes résultats ont démontré que les TNT des cellules neuronales sont constituées de multiples TNT individuelles capables de transporter des vésicules et des mitochondries. En raison des difficultés d'identification des TNT in vivo, mon travail s'est également concentré sur la mise en œuvre d'une approche connectomique structurelle pour détecter les TNT dans les tissus sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un marqueur spécifique aux TNT. Mes résultats indiquent que des structures de type TNT relient les cellules granuleuses cérébelleuses migratoires de souris nouveau-nées, ce qui suggère que la communication intercellulaire pendant les événements migratoires dans le cerveau pourrait être médiée par des processus de type TNT. La squelettisation des structures identifiées fournit à mes résultats des informations géométriques qui peuvent être comparées aux observations faites par des expériences corroboratives de couplage de colorants. Dans l'ensemble, mon travail de thèse met en lumière la formation et la structure des TNT neuronales in vitro, ainsi que de nouvelles approches pour l'identification des TNT in vivo

Peering into tunneling nanotubes—The path forward

International audienceThe identification of Tunneling Nanotubes (TNTs) and TNT-like structures signified a critical turning point in the field of cell-cell communication. With hypothesized roles in development and disease progression, TNTs' ability to transport biological cargo between distant cells has elevated these structures to a unique and privileged position among other mechanisms of intercellular communication. However, the field faces numerous challenges-some of the most pressing issues being the demonstration of TNTs in vivo and understanding how they form and function. Another stumbling block is represented by the vast disparity in structures classified as TNTs. In order to address this ambiguity, we propose a clear nomenclature and provide a comprehensive overview of the existing knowledge concerning TNTs. We also discuss their structure, formation-related pathways, biological function, as well as their proposed role in disease. Furthermore, we pinpoint gaps and dichotomies found across the field and highlight unexplored research avenues. Lastly, we review the methods employed to date and suggest the application of new technologies to better understand these elusive biological structures

Differential identity of Filopodia and Tunneling Nanotubes revealed by the opposite functions of actin regulatory complexes.

International audienceTunneling Nanotubes (TNTs) are actin enriched filopodia-like protrusions that play a pivotal role in long-range intercellular communication. Different pathogens use TNT-like structures as "freeways" to propagate across cells. TNTs are also implicated in cancer and neurodegenerative diseases, making them promising therapeutic targets. Understanding the mechanism of their formation, and their relation with filopodia is of fundamental importance to uncover their physiological function, particularly since filopodia, differently from TNTs, are not able to mediate transfer of cargo between distant cells. Here we studied different regulatory complexes of actin, which play a role in the formation of both these structures. We demonstrate that the filopodia-promoting CDC42/IRSp53/VASP network negatively regulates TNT formation and impairs TNT-mediated intercellular vesicle transfer. Conversely, elevation of Eps8, an actin regulatory protein that inhibits the extension of filopodia in neurons, increases TNT formation. Notably, Eps8-mediated TNT induction requires Eps8 bundling but not its capping activity. Thus, despite their structural similarities, filopodia and TNTs form through distinct molecular mechanisms. Our results further suggest that a switch in the molecular composition in common actin regulatory complexes is critical in driving the formation of either type of membrane protrusion

3D reconstruction of the cerebellar germinal layer reveals tunneling connections between developing granule cells

International audienceThe difficulty of retrieving high-resolution, in vivo evidence of the proliferative and migratory processes occurring in neural germinal zones has limited our understanding of neurodevelopmental mechanisms. Here, we used a connectomic approach using a high-resolution, serial-sectioning scanning electron microscopy volume to investigate the laminar cytoarchitecture of the transient external granular layer (EGL) of the developing cerebellum, where granule cells coordinate a series of mitotic and migratory events. By integrating image segmentation, three-dimensional reconstruction, and deep-learning approaches, we found and characterized anatomically complex intercellular connections bridging pairs of cerebellar granule cells throughout the EGL. Connected cells were either mitotic, migratory, or transitioning between these two cell stages, displaying a chronological continuum of proliferative and migratory events never previously observed in vivo at this resolution. This unprecedented ultrastructural characterization poses intriguing hypotheses about intercellular connectivity between developing progenitors and its possible role in the development of the central nervous system

Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells

The architecture of functional TNTs is still under debate. Here, the authors combine correlative FIB-SEM, light- and cryo-electron microscopy approaches to elucidate the structure of TNTs in neuronal cells, showing that they form structures that are distinct form other membrane protrusions