Binding Domain Analysis Of Phage Display Selected Peptides

Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2007Protein bölgeleri, bağımsız bir şekilde katlanabilen ve istenilen etkileşimi sağlayabilecek özgül 3 boyutlu yapının oluşmasını sağlayan küçük polipeptidleri ifade eder. Gen mühendisliği alanında, bölge içerisinde bulunan ve polipeptidlerin substratlarına doğrudan bağlanmasından sorumlu özel amino asitleri bilmek gereklidir. Amino asitlerin korunmuş pozisyonlarını belirleyerek, stabilizasyon ve fonksiyon için gerekli amino asitler de belirlenebilir. Bu çalışmanın asıl odak noktası site directed mutagenez yöntemleri kullanarak peptidin fonksiyonel kapasitesini değiştirmek ve bu şekilde de seçilmiş belirli bir inorganik yüzeye bağlanmaktan sorumlu amino asit gruplarını bulmaktır. Bu görev, faj gösterim metodu ile seçilmiş platin ve paladyuma özgül olarak bağlanabilen peptidlerin, site directed mutagenez yöntemi ile peptitler faj üzerinde ekspres edildiğinde gerçekleştirilmiştir. Özellikle, serin ve treonin amino asitlerini, bunlara karşılık olarak gelen nötr amino asitler ile değiştirerek, bu amino asitlerin bağlanma üzerindeki etkilerinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. Değiştirilmiş mutantlar, PCR tabanlı site directed mutagenez prosedürü ile oluşturulmuştur. Klonlanan fajların bağlanma karakterizasyonları florasan mikroskobu (FM) ve enzim-bağlı immün essey (ELISA) yöntemleri ile tayin edilerek asal metallerin bağlanma mekanizmaları anlaşılmaya çalışılmıştır. Bu çalışmanın sonuçları, inorganik yüzeylere özgül olarak etkileşime geçen peptidlerin bağlanmadan sorumlu bölgelerinin anlaşılması için kullanılabilir. Biyonanoteknolojik uygulamalar için “seçiciliğe sahip akıllı peptidlerin” oluşturulması ve denenmesi de gerçekleştirilebilir.Protein domains are indepently folding units that represent a small number of polypeptides that creates a specific, 3D structure that leads to a desired interaction. In genetic engineering, it is essential to know the specific amino acid residues within the domain that directly bind polypeptides to their substrates. By identifying the conserved positions of amino acids, those necessary for stabilization and function can be determined. The main focus of this study is to vary the functional capacity of the peptide chain through site directed mutagenesis to determine a core set of amino acids that is responsible for binding to a chosen inorganic surface. This task is accomplished using phage display selected peptides for platinum and palladium via site directed mutagenesis protocols, once they are displayed on phage. In particular, the modification of serine and threonine residues is carried out with respect to their neutral counterparts to reveal a possible role in their binding sequences. Mutants were constructed by a PCR based site directed mutagenesis procedure. Binding characterizations of the cloned phages are assessed by fluorescence microscopy (FM) and enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) to understand the mechanism of noble metal binding. The consequences of this study can be used in understanding of the binding domain of the peptides in their specific interactions with the inorganic surfaces. Smart peptides with selectivity can also be constructed and practiced in bionanotechnological applications.Yüksek LisansM.Sc