Ausencia del virus de Necrosis Hematopoyética Epizoótica (EHNv) en truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) enfermas en piscigranjas de la sierra del Perú

The objective of the present study was to monitor the detection of the Epizootic Hematopoietic Necrosis virus (EHNv) in trouts (Oncorhynchus mykiss) in fish farms of the highlands of Peru. Samples were taken from 111 diseased fish (liver, spleen, anterior kidney) from fish farms in the regions of Ancash, Junín and Huancavelica, Peru. The tissue samples were processed immediately for bacterial isolation and another group of samples were stored at -196 °C for PCR. The DNA of each tissue was extracted by the Trizol method and then purified with silica membranes (PureLink Genomic DNA kit). The PCR was performed using the MCP-1 primers specific for the EHNv, following the methodology proposed by the OIE and with the commercial kit VetPCRTM EHNV Detection for confirmation. Bacterial isolation was carried out by culturing on TSA and Anacker- Ordal agar (Cytophaga agar) of each tissue, and the identification by Gram stain and bacterial biochemistry. The EHNv DNA was not detected indicating that the prevalence of the virus is less than 5% or it is not present in the sampled fish farms. Yersinia ruckeri and Aeromonas spp were isolated in all the samples, indicating that the cause of the disease and mortality present in the fish farms was due to the infection with these bacteria.El objetivo del presente trabajo fue monitorear la detección del virus Necrosis Hematopoyética Epizoótica (EHNv) en truchas (Oncorhynchus mykiss) de piscigranjas de la Sierra del Perú. Se tomaron muestras de 111 peces enfermos (hígado, bazo, riñón anterior) de piscigranjas de las regiones de Áncash, Junín y Huancavelica, Perú. Las muestras de tejidos fueron procesados de inmediato para el aislamiento bacteriano y otro grupo de muestras fueron conservadas a -196 °C para el PCR. El ADN de cada tejido fue extraído mediante el método del Trizol y luego purificado con membranas de sílica (PureLinkGenomic DNA kit). El PCR se realizó utilizando los cebadores MCP-1 específicos para el EHNv siguiendo la metodología propuesta por la OIE y con el kit comercial VetPCRTM EHNV Detection para su confirmación. El aislamiento bacteriano se realizó con el sembrado en agar TSA y Anacker-Ordal (agar citófaga) de cada tejido y la identificación mediante tinción Gram y bioquímica bacteriana. No se detectó el ADN del EHNv en las muestras indicando que la prevalencia del virus es menor al 5% o no está presente en las piscigranjas muestreadas. Se aisló Yersinia ruckeri y Aeromonas spp en todas las muestras, indicando que la causa de la enfermedad y mortalidad presente en las piscigranjas se debían a la infección con estas bacterias

Expression and quantification of RORγt and interleukin-17 in intestinal mucosa of newborn alpaca (Vicugna pacos)

El objetivo del estudio fue determinar los niveles relativos de expresión de ARN mensajeros de RORγt e IL-17 en mucosa intestinal de crías de alpacas clínicamente sanas. Se formaron tres grupos etarios conformados por alpacas de 2 a 7 días (grupo 1, n=5), 8 a 20 días (grupo 2, n=6) y 26 a 47 días (grupo 3, n=6), sin distinción de sexo o raza. Se tomaron muestras del segmento medio del yeyuno, se extrajo el ARN total y se empleó la técnica RT-PCR con cebadores. La expresión relativa de ARNm de RORγt e IL-17 fue determinada por el método 2-∆∆Ct usando como calibradores dos crías neonatas y empleándose como control endógeno a GAPDH. La cinética de expresión de RORγt mostró una tendencia constante durante la primera y tercera semana de vida, alcanzando su máxima expresión en los animales de 2 a 7 días de edad, a diferencia de IL-17 cuya expresión fue progresiva con la edad, evidenciándose una elevada estimulación y expresión desde los primeros días de edad.The aim of the study was to determine the relative levels of expression of messenger RNAs of RORγt and IL-17 in intestinal mucosa of clinically healthy newborn alpacas. Three age groups were formed: 2 to 7 days (group 1, n=5), 8 to 20 days (group 2, n=6) and 26 to 47 days (group 3, n=6), regardless sex or breed. Samples were taken from the middle segment of the jejunum. The total RNA was extracted, and the RT-PCR technique was used with specific primers. The relative expression of mRNA of RORγt and IL-17 was determined by the 2-ΔΔCt method using two neonatal pups as calibrators and using GAPDH as an endogenous control. The kinetics of expression of RORγt showed a constant trend during the first and third week of life, reaching its maximum expression in animals from 2 to 7 days of age, unlike IL-17 whose expression was progressive with age, evidencing a high stimulation and expression from the first days of age

Effect of retinoic acid on expression of receptor ccr9 and alpha 4 beta 7 integrin in alpaca blood leukocytes (Vicugna pacos)

Las células T efectoras (CD4+ y CD8+) y de memoria pueden migrar a la mayoría de los tejidos extra-linfoides en el cuerpo, pero requieren la expresión de receptores de alojamiento (homing) específicos en las células T, la integrina A4B7 y el receptor de quimiocina CCR9. Los linfocitos circulantes CD4+ o CD8+ carecen de receptores CCR9 y A4B7; sin embargo, expresan este tipo de receptores al alcanzar la mucosa intestinal. El objetivo del estudio fue determinar el efecto del ácido retinoico sobre la expresión de los receptores CCR9 y la integrina A4B7análisis in vitro de muestra de sangre circulante de alpaca. Los leucocitos obtenidos se colocaron en placas de cultivo celular en medio esencial mínimo (MEM) suplementados e inoculados con ácido retinoico a concentraciones de 10, 50 y 100 ug/ml disuelto en DMSO. Se empleó un control a base de suero fisiológico. Las placas de cultivo celular fueron incubadas por 12, 24 y 48 h a 37 ºC con CO2 al 5%. Se realizó las PCR en Tiempo Real de los ARNm del receptor CCR9 y la integrina A4B7 y la cuantificación relativa con el método 2-ÄÄCt. Las máximas expresiones para CCR9 se dieron a las 48 h para las concentraciones de 10 y 100 ug/ml de ácido retinoico y DMSO, y a las 24 h para la concentración de 50 ug/ml. El control presentó expresiones mucho más elevadas en comparación con las dosis de ácido retinoico y DMSO. No hubo expresión para la integrina A4B7.Effector T cells (CD4+ and CD8+) and memory cells can migrate to most extra lymphoid tissues in the body, but require the expression of specific homing receptors in T cells, α4β7 integrin and receptor chemokine CCR9. CD4+ or CD8+ circulating lymphocytes lack CCR9 and α4β7 receptors; however, these receptors are expressed upon reaching the intestinal mucosa. The aim of the study was to determine the effect of retinoic acid on the expression of CCR9 receptors and α4β7 integrin on alpaca lymphocytes (Vicugna pacos). An in vitro analysis of circulating alpaca blood sample was performed. The obtained leukocytes were placed in cell culture plates in minimal essential medium (MEM) supplemented with retinoic acid at concentrations of 10, 50 and 100 ìg/ml dissolved in DMSO. A control based on physiological serum was used. Cell culture plates were incubated for 12, 24 and 48 h at 37 °C with 5% CO2. Real-time PCR of the CCR9 receptor mRNA and α4β7 integrin and relative quantification with the 2-ΔΔCt method were performed. The maximum expressions for CCR9 were given at 48 h for concentrations of 10 and 100 μg/ml of retinoic acid and DMSO, and at 24 h for the concentration of 50 μg/ml. The control had much higher expressions compared to the doses of retinoic acid and DMSO. There was no expression for the α4β7 integrin

Isolation and molecular detection of emerging porcine epidemic diarrhea virus strains in Lima, Peru

En 2013 se observaron cuadros clínicos sugerentes a PEDv en granjas porcinas de Lima y Arequipa llegando hasta el 100% de mortalidad en lechones y con resultados negativos a otros agentes virales como peste porcina clásica (PPCv) y gastroenteritis transmisible (TGEv). Por esta razón, el objetivo del trabajo fue aislar y detectar molecularmente cepas del PEDv en granjas porcinas de Lima. Se colectaron 37 muestras de heces y contenido intestinal de lechones entre 2 y 21 días de edad con cuadros clínicos sugerentes a PEDV procedentes granjas porcinas del departamento de Lima, Perú. El 94.3% (35/37) resultaron positivos al test de inmunocromatografía (IHC). El 97.1% (34/35) de estos fueron confirmados por RT-PCR en tiempo real que amplifica un segmento de 101 pb del gen ORF3 del PEDv. El control y las muestras positivas mostraron un ciclo umbral (Ct) entre 10 y 21 ciclos con una temperatura de disociación (Tm) de 77.7 °C. No hubo amplificación de TGEv ni PPCv utilizados como controles negativos. Todas las muestras positivas fueron procesadas para el aislamiento en la línea celular VERO-21 suplementado con 20 μg/ml tripsina. El 23.5% (8/34) de las células mostraron formas redondeadas y lisis en el cultivo celular entre el primer y segundo pasaje; sin embargo, solo la mitad (4/8) fueron confirmadas por RT-PCR en tiempo real. Este trabajo representa el primer aislamiento del PEDv en el Perú utilizando IHC y confirmado por RT-PCR en tiempo real.In 2013, clinically suggestive cases of PEDv were reported in pig farms in Lima and Arequipa, reaching up to 100% mortality in piglets and negative results to other viral agents such as classical swine fever (CPPv) and transmissible gastroenteritis (TGEv). For this reason, the aim of this study was to isolate and molecularly detect PEDv strains in Lima pig farms. A total of 37 stool samples and intestinal contents of piglets between 2 and 21 days of age with clinical signs suggestive of PEDv from pig farms of the department of Lima, Peru were collected. Results showed that 94.3% (35/37) were positive by the immunochromatography (IHC) test; 97.1% (34/35) of them were confirmed by RT-PCR real-time that amplified a 101-bp segment of the ORF3 gene of the PEDv. The control and positive samples showed a threshold cycle (Ct) between 10 and 21 cycles with a melting temperature (Tm) of 77.7 °C. There was no amplification of TGEv or PPCv used as negative controls. All positive samples were processed for isolation in the VERO-21 cell line supplemented with 20 μg/ml trypsin. The 23.5% (8/34) of the inoculated cells showed rounded shapes and lysis in cell culture between the first and second passage; however, only half (4/8) were confirmed by RT-PCR real-time. This work represents the first isolation of PEDv in Peru using IHC and confirmed by RT-PCR real-time

Interleukin 10 (IL-10) and transforming growth factor beta (TGF- ß) expression in intestinal mucosa of alpaca crias (Vicugna pacos)

El objetivo del trabajo fue evaluar los niveles de expresión relativa de los genes de las citoquinas IL-10 y TGF-β en la mucosa intestinal de alpacas de 2 a 47 días de edad, clínicamente sanas. Se formaron tres grupos etarios (seis crías por grupo) conformados por alpacas de 2 a 8 días (grupo 1), 10 a 21 días (grupo 2) y 26 a 47 días (grupo 3), sin distinción de sexo o raza. Se tomó la porción media del yeyuno de cada animal, se extrajo el ARN total y se empleó la técnica RT-PCR en tiempo-real con cebadores específicos para las citoquinas en estudio. La expresión relativa de ARNm de IL10 y TGF-β fue determinada por el método comparativo 2-ΔΔCt usando como calibrador el yeyuno de tres fetos de 11 meses de gestación y como gen endógeno el gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). La expresión promedio de ARNm de IL-10 fue de 7.21±1.02 (grupo 1), 13.53±1.26 (grupo 2) y 18.77±1.48 (grupo 3) veces lo expresado por el grupo calibrador, mostrando diferencia significativa (p<0.05) entre grupos etarios. La expresión promedio de ARNm de TGF-β fue de 2.18±0.23 (grupo 1), 3.03±0.18 (grupo 2) y 4.06±0.15 (grupo 3) veces lo expresado por el grupo calibrador, mostrando diferencia significativa (p<0.05) entre grupos etarios. La expresión de ARNm de IL-10 y TGF-β fue dependiente de la edad, incrementándose significativamente con la mayor edad de las crías.The aim of the present study was to evaluate the relative expression levels of cytokines IL-10 and TGF-β in the intestinal mucosa of clinically healthy alpacas from 2 to 47 days old. The animals were classified in three age groups (six animals per group): 2-8 days old (group 1), 10-21days old (group 2) and 26-47-days old (group 3), regardless sex or breed. The midportion of jejunum of each animal was collected; total RNA was extracted and then analyzed by real-time RT-PCR technique using IL-10 and TGF-β specific primers. The relative mRNA expression analysis was done using the comparative 2-ΔΔCt method. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as housekeeping gene and jejunum of three 11-month-old fetuses were used as calibrators. The results showed that IL-10 mRNA expression levels were 7.21±1.02 (group 1), 13.53±1.26 (group 2), and 18.77±1.48 (group 3) times as expressed by the calibrate group with significant difference between age groups (p<0.05). Also, TGF-β mRNA expression levels were 2.18±0.23 (group 1), 3.03±0.18 (group 2), and 4.06±0.15 (group 3) times as expressed by the calibrate group with significant difference between age groups (p<0.05). The expression of IL-10 and TGF-β mRNA was age dependent, increasing significantly in older animals

Expression of TCRγδ receptor genes in jejunum mucosa of baby alpacas (Vicugna pacos)

El objetivo de este estudio fue determinar la expresión de genes del receptor TCRγδ (gamma y delta) en el epitelio yeyunal de 16 crías de alpaca aparentemente sanas, de 2 a 47 días de edad, mediante la cuantificación de ARN mensajero (ARNm) utilizando cebadores específicos. Se tomaron porciones de yeyuno (2 cm de longitud). El ARNm total de la mucosa de la porción media del yeyuno actuó como molde para la síntesis de ADN complementario mediante transcripción reversa (RT), seguida de un PCR-tiempo real para la amplificación y cuantificación de los ARNm de los polipéptidos que conforman las cadenas gamma y delta del TCR. Se utilizó el método 2-ΔΔCt para la cuantificación relativa de ARNm, teniendo como calibrador a dos crías neonatas que no habían consumido calostro. Las crías de 1, 2, 3 y ≥4 semanas de edad expresaron el gen gamma en 4.75, 6.78, 16.24 y 103.11 veces lo expresado por los animales calibradores, respectivamente, y el gen delta fue expresado en 9.43, 20.78, 25.08 y 146.46 veces, respectivamente. Los resultados demuestran que los genes gamma y delta se expresan en forma creciente con la edad, y significativamente a partir de la cuarta semana de edad (p<0.05), indicando que los linfocitos Tγδ se incrementan en la mucosa intestinal con la edad.The aim of this study was to determine the expression of TCRγδ receptor genes (gamma and delta) in the jejunal epithelium of 16 apparently healthy baby alpacas (2 to 47 days of age), by quantifying messenger RNA (mRNA) using specific primers. Jejunumsamples (2 cm long) were collected. Total mRNA of the medium portion of the jejunum acted as template for complementary DNA synthesis by reverse transcription (RT), followed by real-time PCR for the amplification and quantification of the mRNAs of the polypeptides that make up the gamma and delta chains of the TCR. The 2-ΔΔCt method was used for the relative mRNA quantification, using as calibrator two neonatal alpacas that had not consumed colostrum. The alpacas of 1, 2, 3 and >4 weeks of age expressed the gamma gene at 4.75, 6.78, 16.24 and 103.11 folds as expressed by the calibrator animals, respectively, and the delta gene was expressed at 9.43, 20.78, 25.08, and 146.46 folds, respectively. The results demonstrate that gamma and delta genes are increasingly expressed with age, and significantly from the fourth week of age (p<0.05), indicating that Tγδ lymphocytes increase in the intestinal mucosa with age

Caracterización molecular del segmento 4 del virus de la tilapia de lago aislado de tilapias (Oreochromis niloticus) cultivadas en Perú

The aim of this study was the molecular characterization of segment 4 of the lake tilapia virus (TiLV) detected in farmed tilapia from the departments of Piura (Coast) and San Martín (Jungle) in an outbreak that occurred in 2017-2018. During this outbreak, 26 TiLV positive samples were obtained and five of them were selected. The diagnosis of these samples was carried out through a nested RT-PCR with primers directed to segment 3 and the PCR products were sequenced. For the amplification and analysis of segment 4 of the TiLV genome, an RT-PCR was performed where specific primers were designed. The sequencing was done by Macrogen (South Korea), by bidirectional sequencing using the automated Sanger method. The phylogenetic analysis was carried out from the aligned sequences by means of the Neighbor-Joining (NJ) method and the hypothetical protein characteristics of the gene was carried out with the Phyre2 program. Four sequences with a length of 1190 bp were obtained and compared with two sequences from Israel and one from Thailand, reference strains corresponding to segment 4 of TILV published GenBank. The phylogenetic analysis of segment 4 determined the presence of a local TiLV genogroup, in addition to indicating that the Peruvian samples have a greater genetic relationship with the clade of Israel strains. The genetic distance analysis shows that the Peruvian samples have nucleotide identity values of 99.7-100% between them, determining that the outbreaks of both locations were produced by the same viral strain, and have an identity of 97.5-97.7% with strains from Israel and 97.0-97.1% with strains from Thailand. The hypothetical protein from TiLV segment 4 was determined to have structural homology to the neuraminidase N6 protein from English duck influenza A virus with 12% coverage, 44% identity, and 24.9% confidence.El objetivo del presente estudio fue la caracterización molecular del segmento 4 del virus de la tilapia de lago (TiLV) detectado en tilapias de cultivo de los departamentos de Piura (Costa) y San Martín (Selva) en un brote ocurrido en 2017-2018. En el brote se obtuvo 26 muestras positivas a TiLV, de las cuales se seleccionaron cinco muestras positivas. El diagnóstico de estas muestras se realizó a través de un RT-PCR anidado con cebadores dirigidos al segmento 3 y los productos de PCR fueron secuenciados. Para la amplificación y análisis del segmento 4 del genoma del TiLV se realizó un RT-PCR donde se diseñaron cebadores específicos. La secuenciación se hizo con la empresa Macrogen (Corea del Sur), mediante secuenciación bidireccional por el método de Sanger automatizado. El análisis filogenético se realizó a partir de las secuencias alineadas por medio del método de Neighbor-Joining (NJ) y la característica de la proteína hipotética del gen se realizó con el programa Phyre2. Se obtuvieron cuatro secuencias completas del segmento 4 (1 de Piura y 3 de San Martín) con una longitud de 1190 pb siendo comparadas con dos secuencias de Israel y una de Tailandia, cepas referenciales correspondientes al segmento 4 de TILV publicadas GeneBank. El análisis filogenético del segmento 4 determinó la presencia de un genogrupo TiLV local, además de indicar que las muestras peruanas presentan mayor relación genética con el clado de cepas de Israel. El análisis de distancia genética muestra que las muestras peruanas mostraron valores de identidad nucleotídica de 99.7-100% entre ellas, determinando que los brotes de ambos lugares fueron producidos por la misma cepa viral, y tienen una identidad de 97.5-97.7% con cepas de Israel y 97.0-97.1% con cepas de Tailandia. Se determinó que la proteína hipotética a partir del segmento 4 del TiLV tiene una región con una homología estructural con la proteína neuraminidasa N6 del pato inglés con 12% de cobertura, 44% de identidad y 24.9% de confianza

Efecto in vitro del Extracto Proteico de Macroquistes de Sarcocytis aucheniae sobre la Viabilidad y Degranulación de Leucocitos de Conejo (Oryctologus cuniculus)

The aim of this study was to determine the in vitro toxic effect of the protein extract of macrocysts of Sarcocystis aucheniae on circulating rabbit leukocytes (cytotoxicity). Five concentrations of the protein extract (0.5, 1, 50, 500, 1000 ng/100 μl) were exposed to a population of 500 000 leukocystes/ml for 1 and 12 h in a culture medium at 37 °C. The cell viability was evaluated by trypan blue exclusion and the enzyme degranulation of leukocytes (myeloperoxidase and glucosaminidase ) by polyacrylamide gel electrophoresis and transfered to nitrocellulose membranes (Western blotting). The cell count at 1 h of incubation showed high mortality (57.7 to 58.1%), whereas at 12 h varied from 65.2 to 99.4%, and without statistical differences between the mean of leukocytes that survive in each treatment. Mortality in the control group (saline) was 5 and 57% at 1 and 12 h of incubation respectively. On leukocyte degranulation the inoculated groups secreted different proteins than the control group inoculated with saline as evidenced by staining bands in controlling protein transfer membranes. It was concluded that the protein extract of S. aucheniae macrocysts is highly cytotoxic to rabbit leukocytes and protein secretion is observed.En el presente trabajo se buscó determinar el efecto tóxico in vitro del extracto proteico de macroquistes de Sarcocystis aucheniae sobre leucocitos circulantes de conejo (citotoxicidad). Se trabajó con cinco concentraciones de extracto proteico (0.5, 1, 50, 500, 1000 ng/100 ìl) en una población de 500 000 leucocitos/ml incubados por 1 y 12 horas en un medio de cultivo a 37 ºC. Se determinó la viabilidad celular por exclusión con azul de tripán y la degranulación de enzimas leucocitarias (mieloperoxidasa y glucosaminidasa) mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y transferencia a membranas de nitrocelulosa (Western blotting). El recuento de células a 1 h de incubación demostró una alta mortalidad (57.7 a 58.1%), siendo a las 12 h entre 65.2 y 99.4%, y sin diferencia estadística entre las medias del número de leucocitos que sobreviven a cada tratamiento. La mortalidad en el grupo control de suero fisiológico alcanzó 5 y 57% a 1 y 12 h de incubación, respectivamente. En la degranulación de leucocitos se observó la secreción de proteínas diferentes a aquellas en el grupo control inoculado con suero fisiológico, evidenciado por la tinción de bandas en las membranas de transferencia. Se concluye que el extracto proteico de macroquistes de S. aucheniae es altamente citotóxico para los leucocitos de conejo y se observa la secreción de proteínas

Effect of Clostridium perfringens antigens and acid retinoic on IgA expression in the intestinal mucosa of newborn alpacas (Vicugna pacos)

El objetivo del estudio fue comparar los niveles de expresión relativa del gen del exón 1 de la IgA en el epitelio intestinal de las crías de alpacas tratadas y no tratadas con antígenos de Clostridium perfringens más ácido holotransretinoico (ATRA) por vía oral. Se muestrearon 32 animales: 14 tratados (6 de 1 día de edad y 8 entre 7 a 14 días de edad) y 18 no tratados (10 de 1 día de edad y 8 entre 7 a 14 días de edad). Los animales fueron sacrificados a la semana del tratamiento, se recolectó un segmento de 2 cm de yeyuno y se almacenó a -196 °C. De cada muestra se realizó la extracción de ARN total con el método de TRIzol® y luego se realizó la técnica del RT PCR a tiempo real empleando oligonucleótidos diseñados para la detección del exón 1 del gen de inmunoglobulina A (IgA) de alpaca. La cuantificación de la expresión relativa mediante normalización con ARNm del gen GAPDH y los cálculos de la expresión relativa se realizaron utilizando el método Ct comparativo (2-ΔΔCt). Los resultados indicaron que la administración de antígenos de C. perfringens y ATRA ejerce un efecto inmunomodulador positivo sobre la expresión de IgA en mucosa intestinal de crías de alpacas tratadas. Los animales tratados de ambos grupos etarios presentaron mayor producción de ARNm de IgA en relación a los animales controles (p<0.05).The aim of this study was to compare the relative expression levels of the gene from exon 1 of the IgA in the intestinal epithelium of baby alpacas untreated and treated orally with Clostridium perfringens antigens and all-trans retinoic acid (ATRA). Thirty two animals were sampled: 14 treated (6 of 1 day old and 8 between 7-14 days old) and 18 untreated (10 of 1 day old and 8 between 7-14 days old). The animals were slaughtered after one week of the treatment and 2 cm of the jejunum was collected and kept at -196 °C. Total RNA was extracted from each sample using the TRIzol® method and complementary DNA (cDNA) was synthesized. PCR and RT-PCR Real Time were conducted using specific oligonucleotides designed for the detection of exon 1 of the region Fc IgA in the alpaca. The quantification of the relative expression by normalization with GAPDH gene mRNA and the relative expression calculations were performed using the comparative Ct method (2-ΔΔCt). The results showed that the administration of C. perfringens antigens and ATRA exerts positive immunomodulatory effect of IgA on the intestinal mucosa of treated baby alpacas. Animals of both age groups showed higher IgA mRNA production with respect the non-treated animals (p<0.05)

ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA RT-PCR TIEMPO REAL PARA LA DETECCIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA (VNPI) EN TRUCHAS ARCO IRIS (Oncorhynchus mykiss).

The objective of this study was to standardize and validate the real-time RT-PCR technique for diagnosis of Infectious Pancreatic Necrosis virus (IPNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from Central Sierra of Peru. Samples of kidney and spleen (n=61) of rainbow trout with apparent clinical signs of IPN and from rainbow trout apparently healthy (n=60) were collected from two fish farms located in the central sierra. Before standardization of the real-time RT-PCR technique, the kidney and spleen samples of 121 rainbow trout were tested for antigen of IPNV by indirect immunofluorescent (IIF) test. In addition, kidney and spleen samples of 10 rainbow trout negative to IPNV by IIF were inoculated with a serial dilution of IPNV strain (from initial concentration of 103 PFU/ml). The RNA extraction of the 121 samples and of the 10 samples inoculated with IPNV strain, the cDNA and the real-time RT-PCR were carried out by commercial kits. The WB1 and WB2 primers were used to amplify a segment that codifies the protein VP2 of the Aquabirnavirus. A strain of IPNV as a positive control and Rotavirus A strain, Gumboro disease virus, bovine viral diarrhea virus, and parainfluenza-3 were used as negative controls. The 121 kidney and spleen samples were negative to IPNV by IIF test. The results of real time RT-PCR technique were evaluated considering the cycle threshold values of 31.7 and temperature melting of 80.4 °C of the amplicons. The real time RT-PCR technique was able to detect a concentration of 102 PFU/ml of IPNV in the kidney and spleen samples inoculated and the 121 of kidney and spleen samples were negative to IPNV. This technique had 100% of sensibility and specificity for detection of IPNV.El objetivo del presente estudio fue estandarizar y validar la técnica de RT-PCR tiempo real para el diagnóstico del virus de Necrosis Pancreática Infecciosa (VNPI) en truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) de la sierra central del Perú. Se colectaron muestras de riñón y bazo de truchas con aparentes signos clínicos de necrosis pancreática infecciosa (NPI) (n= 61) y truchas aparentemente sanas (n= 60) de dos piscigranjas del valle del Mantaro, Junín. Previo a la estandarización, las muestras fueron procesadas para la detección de antígeno del VNPI por inmunofluorescencia indirecta (IFI). Diez muestras de riñón y bazo de truchas negativas al VNPI por IFI fueron inoculados con una cepa del VNPI con título de 103 UFP/ml. La extracción del ácido nucleico del VNPI de las 121 muestras de riñón y bazo y de las 10 muestras de riñón y bazo inoculadas con el VNPI, la síntesis del ADN complementario y la RT-PCR tiempo real se realizaron utilizando kits comerciales. Se usaron los cebadores WB1 y WB2 correspondientes a un segmento del gen que codifica la proteína VP2 de los Aquabirnavirus. Una cepa del VNPI fue utilizada como control positivo y cepa de Rotavirus A, virus de Gumboro, virus de diarrea viral bovina, parainfluenza 3 como controles negativos. Las 121 muestras de riñón y bazo de las truchas arco iris resultaron negativas al VNPI por IFI. Los resultados de la RT-PCR en tiempo real fueron determinados en función a los valores del ciclo de amplificación que fue de 31.7 y temperatura de disociación de 80.4 °C de los productos del virus control positivo. La técnica de RT-PCR en tiempo real fue capaz de detectar hasta una concentración de 102 DI50UFP/ml del VNPI en las muestras de riñón y bazo inoculadas, mientras que las 121 muestras de truchas resultaron negativas al VNPI. La técnica de RT-PCR en tiempo real tuvo 100% de sensibilidad y especificidad en la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa en truchas arco iris