A Shift in Paradigms: Spatial Genomics Approaches to Reveal Single-Cell Principles of Genome Organization

The genome tridimensional (3D) organization and its role towards the regulation of key cell processes such as transcription is currently a main question in biology. Interphase chromosomes are spatially segregated into “territories,” epigenetically-defined large domains of chromatin that interact to form “compartments” with common transcriptional status, and insulator-flanked domains called “topologically associating domains” (TADs). Moreover, chromatin organizes around nuclear structures such as lamina, speckles, or the nucleolus to acquire a higher-order genome organization. Due to recent technological advances, the different hierarchies are being solved. Particularly, advances in microscopy technologies are shedding light on the genome structure at multiple levels. Intriguingly, more and more reports point to high variability and stochasticity at the single-cell level. However, the functional consequences of such variability in genome conformation are still unsolved. Here, I will discuss the implication of the cell-to-cell heterogeneity at the different scales in the context of newly developed imaging approaches, particularly multiplexed Fluorescence in situ hybridization methods that enabled “chromatin tracing.” Extensions of these methods are now combining spatial information of dozens to thousands of genomic loci with the localization of nuclear features such as the nucleolus, nuclear speckles, or even histone modifications, creating the fast-moving field of “spatial genomics.” As our view of genome organization shifts the focus from ensemble to single-cell, new insights to fundamental questions begin to emerge.Fil: Cardozo Gizzi, Andres Mauricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Grupo Vinculado Centro de Investigación en Medicina Traslacional Severo R. Amuchástegui - Cimetsa | Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Grupo Vinculado Centro de Investigación en Medicina Traslacional Severo R. Amuchástegui - Cimetsa | Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Grupo Vinculado Centro de Investigación en Medicina Traslacional Severo R. Amuchástegui - Cimetsa; Argentina. Instituto Universitario de Ciencias Biomédicas de Córdoba; Argentin

Mecanismo molecular de la activación de la síntesis de fosfolípidos por la proto-oncoproteína C-Fos

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015La proto-oncoproteína c-Fos es un factor de transcripción tipo AP-1 cuya función fue descripta hace más de 25 años (Curran & Morgan 1987). En su función canónica, c-Fos forma heterodímeros funcionales con proteínas de las familias Jun, ATF o JDP, que se unen a regiones específicas del ADN y promueven la transcripción de múltiples genes blanco (Hess et al. 2004). Esta actividad AP-1 ha sido involucrada en la transformación de señales de crecimiento de corta duración en cambios de larga duración al regular la expresión de genes involucrados en el crecimiento celular. Evidencias previas del laboratorio han demostrado que la proteína c-Fos, de manera independiente de su actividad como factor de transcripción tipo AP-1, activa la síntesis de fosfolípidos al asociarse al retículo endoplásmico (Caputto et al. 2014). El objetivo principal de esta Tesis fue estudiar la actividad no genómica de c-Fos por la es capaz de activar la síntesis de lípidos, y en particular el mecanismo molecular por el cual c-Fos ejerce este efecto. Encontramos que para alcanzar el incremento en el marcado radioactivo de todas las especies de fosfolípidos analizadas, c-Fos afecta positivamente solo etapas metabólicas específicas. Utilizando homogeneizados de células NIH3T3 quiescentes, encontramos que c- Fos recombinante activa in vitro la actividad de CDP-diacilglicerol sintasa, Lipin 1 y fosfatidilinositol 4-quinasa tipo II pero no fosfatidilinositol sintasa. La constante cinética Vmax se incrementó para todas las enzimas analizadas mientras que no se observó ningún efecto en Km, una medida de la afinidad de la enzima por su sustrato. Más aún, hemos probado la activación in vitro en un sistema purificado que contiene sólo a c-Fos, Lipin 1 y membranas modelo compuestas de micelas mixtas de Triton X-100/PA. En este sistema altamente simplificado, encontramos que c-Fos incrementa la actividad enzimática de Lipin1 sin modificar la afinidad de esta por las membranas modelo. En orden de explicar el mecanismo de activación enzimática, realizamos ensayos de interacción proteína-proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación y de microscopía FRET establecimos una interacción física entre c-Fos y las enzimas que activa mientras que esta no se produce con aquellas enzimas cuya actividad c-Fos no regula. El empleo de mutantes de deleción permitió determinar que la región involucrada en la activación enzimática es diferente de la región responsable de la unión a enzimas específicas, y que estas regiones de asociación/activación son comunes a todas las enzimas estudiadas. Mientras que la región de activación es el dominio básico de c-Fos, la región de asociación se encuentra en el N-terminal de la proteína. Los resultados apoyan nuestra hipótesis de un mecanismo compartido en la activación de la síntesis de fosfolípidos en el que c-Fos se asocia físicamente con las enzimas responsables de la síntesis de fosfolípidos que es capaz de activar modificando su eficiencia catalítica sin alterar la afinidad de la enzima blanco por su sustrato. A su vez, refuerzan el concepto de una proteína que posee dos funciones diferenciales como lo son la de su actividad como factor de transcripción y la capacidad de incrementar actividades enzimáticas claves per se, para de esta forma sostener eventos de proliferación o diferenciación celular

Evaluación de respuesta productiva en soja según variedades y densidad de siembra

Trabajo Final Integrador (Área de Consolidación Sistemas Agrícolas de Producción Extensivos - Ingeniería Agronómica) -- UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2018El cultivo de soja es uno de los más importantes a nivel nacional, se utilizan grupos de madurez (GM) que van del II al VIII, y más de 500 variedades diferentes. La densidad de siembra utilizada por los productores es muy variable, con valores que van de 20 a 45 plantas/m2, lo que se podría explicar por la baja calidad de semilla y la buena rentabilidad obtenida a pesar de utilizar densidades excesivamente altas. En el contexto actual del aumento de precios de insumos y creciente calidad de semilla, surge el interrogante de la posibilidad de obtener altos rendimientos disminuyendo su uso. El objetivo del trabajo fue determinar si hay diferencias estadísticas entre densidades de siembra y entre los cultivares evaluados. Para esto, se llevó a cabo un ensayo en el Campo Escuela de la FCA- UNC en la campaña 16/17, donde se evaluaron 4 cultivares distintos que van del GM IV largo a VI corto, y se sembraron en dos densidades, 9 y 18 plantas/metro lineal (Pl/m lineal), todas con la misma fecha de siembra (FS). Las variedades analizadas fueron: DM 4612, NA 5009, DM 5.9 y CZ 6205. Se realizó un diseño de 7 franjas de 500 m de largo, una para DM 5009 la cual fue el testigo y el resto de las variedades con dos franjas cada una correspondiendo a alta densidad (AD) y baja densidad (BD). Durante el ciclo del cultivo se evaluó el estado de desarrollo. Posteriormente se tomaron tres muestras de 1 m2 en cada franja y luego fueron medidas y/o evaluadas las siguientes variables: cantidad Pl/m lineal a cosecha, rendimiento (RTO), número de granos por m2 (NG), peso de mil granos (PMG), biomasa aérea e índice de cosecha (IC). La evaluación estadística de los datos se hizo con el software Infostat, mediante ANAVA y pruebas de diferencia de medias con test LSD Fisher. Se observó que hubo diferencias estadísticamente significativas entre variedades, siendo la de GM más corto, (DM 4612), la que obtuvo mayor rendimiento y con diferencias significativas con respecto al resto. A su vez, entre densidades no hubo diferencias

The moonlighting protein c-Fos activates lipid synthesis in neurons, an activity that is critical for cellular differentiation and cortical development

Differentiation of neuronal cells is crucial for the development and function of the nervous system. This process involves high rates of membrane expansion, during which the synthesis of membrane lipids must be tightly regulated. In this work, using a variety of molecular and biochemical assays and approaches, including immunofluorescence microscopy and FRET analyses, we demonstrate that the proto-oncogene c-Fos (c-Fos) activates cytoplasmic lipid synthesis in the central nervous system and thereby supports neuronal differentiation. Specifically, in hippocampal primary cultures, blocking c-Fos expression or its activity impairs neuronal differentiation. When examining its subcellular localization, we found that c-Fos co-localizes with endoplasmic reticulum markers and strongly interacts with lipid-synthesizing enzymes, whose activities were markedly increased in vitro in the presence of recombinant c-Fos. Of note, the expression of c-Fos dominant-negative variants capable of blocking its lipid synthesis–activating activity impaired neuronal differentiation. Moreover, using an in utero electroporation model, we observed that neurons with blocked c-Fos expression or lacking its AP-1–independent activity fail to initiate cortical development. These results highlight the importance of c-Fos–mediated activation of lipid synthesis for proper nervous system development.Fil: Rodríguez Berdini, Lucia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Ferrero, Gabriel Orlando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigación y Tecnología Química. Universidad Tecnológica Nacional. Facultad Regional Córdoba. Centro de Investigación y Tecnología Química; ArgentinaFil: Bustos, Julia Florentyna. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Cardozo Gizzi, Andres Mauricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Prucca, Cesar German. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Quiroga, Santiago. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Caputto, Beatriz Leonor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

Cis-regulatory chromatin loops arise before TADs and gene activation, and are independent of cell fate during early Drosophila development

Acquisition of cell fate is thought to rely on the specific interaction of remote cis-regulatory modules (CRMs), for example, enhancers and target promoters. However, the precise interplay between chromatin structure and gene expression is still unclear, particularly within multicellular developing organisms. In the present study, we employ Hi-M, a single-cell spatial genomics approach, to detect CRM–promoter looping interactions within topologically associating domains (TADs) during early Drosophila development. By comparing cis-regulatory loops in alternate cell types, we show that physical proximity does not necessarily instruct transcriptional states. Moreover, multi-way analyses reveal that multiple CRMs spatially coalesce to form hubs. Loops and CRM hubs are established early during development, before the emergence of TADs. Moreover, CRM hubs are formed, in part, via the action of the pioneer transcription factor Zelda and precede transcriptional activation. Our approach provides insight into the role of CRM–promoter interactions in defining transcriptional states, as well as distinct cell types.Fil: Espínola, Sergio Martín. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; Francia. Université de Montpellier. Centre de Biologie Structurale; FranciaFil: Götz, Markus. Université de Montpellier. Centre de Biologie Structurale; Francia. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; FranciaFil: Bellec, Maelle. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Université de Montpellier. Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier; Francia. Université de Montpellier. Centre de Biologie Structurale; Francia. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; FranciaFil: Messina, Olivier. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Université de Montpellier. Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier; Francia. Université de Montpellier. Centre de Biologie Structurale; Francia. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; FranciaFil: Fiche, Jean Bernard. Université de Montpellier. Centre de Biologie Structurale; Francia. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; FranciaFil: Houbron, Christophe. Université de Montpellier. Centre de Biologie Structurale; Francia. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; Francia. Centre National de la Recherche Scientifique; FranciaFil: Dejean, Matthieu. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Université de Montpellier. Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier; FranciaFil: Reim, Ingolf. Universitat Erlangen Nuremberg; AlemaniaFil: Cardozo Gizzi, Andres Mauricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto Alberto C. Taquini de Investigaciones en Medicina Traslacional - Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Cardiológicas "Prof. Dr. Alberto C. Taquini". Instituto Alberto C. Taquini de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Lagha, Mounia. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Université de Montpellier. Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier; FranciaFil: Nollmann, Marcelo. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; Francia. Université de Montpellier. Centre de Biologie Structurale; Franci

TADs or no TADS: Lessons from single-cell imaging of chromosome architecture

Eukaryotic genomes are folded in a hierarchical organization that reflects and possibly regulates their function. Genomewide studies revealed a new level of organization at the kilobase-to-megabase scale termed “topological associating domains” (TADs). TADs are characterized as stable units of chromosome organization that restrict the action of regulatory sequences within one “functional unit.” Consequently, TADs are expected to appear as physical entities in most cells. Very recent single-cell studies have shown a notable variability in genome architecture at this scale, raising concerns about this model. Furthermore, the direct and simultaneous observation of genome architecture and transcriptional output showed the lack of stable interactions between regulatory sequences in transcribing cells. These findings are consistent with a large body of evidence suggesting that genome organization is highly heterogeneous at different scales. In this review, we discuss the main strategies employed to image chromatin organization, present the latest state-of-the-art developments, and propose an interpretation reconciling population-based findings with direct single-cell chromatin organization observations. All in all, we propose that TADs are made of multiple, low-frequency, low-affinity interactions that increase the probability, but are not deterministic, of regulatory interactions.Fil: Cardozo Gizzi, Andres Mauricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Cattoni, Diego Ignacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; FranciaFil: Nollmann, Marcelo. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; Franci

c-Fos: An AP-1 transcription factor with an additional cytoplasmic, non-genomic lipid synthesis activation capacity

The mechanisms that co-ordinately activate lipid synthesis when high rates of membrane biogenesis are needed to support cell growth are largely unknown. c-Fos, a well known AP-1 transcription factor, has emerged as a unique protein with the capacity to associate to specific enzymes of the pathway of synthesis of phospholipids at the endoplasmic reticulum and activate their synthesis to accompany genomic decisions of growth. Herein, we discuss this cytoplasmic, non-genomic effect of c-Fos in the context of other mechanisms that have been proposed to regulate lipid synthesis.Fil: Caputto, Beatriz Leonor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Cardozo Gizzi, Andres Mauricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Gil, German Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

c-Fos activates and physically interacts with specific enzymes of the pathway of synthesis of polyphosphoinositides

The oncoprotein c-Fos is a well-recognized AP-1 transcription factor. In addition, this protein associates with the endoplasmic reticulum and activates the synthesis of phospholipids. However, the mechanism by which c-Fos stimulates the synthesis of phospholipids in general and the specific lipid pathways activated are unknown. Here we show that induction of quiescent cells to reenter growth promotes an increase in the labeling of polyphosphoinositides that depends on the expression of c-Fos. We also investigated whether stimulation by c-Fos of the synthesis of phosphatidylinositol and its phosphorylated derivatives depends on the activation of enzymes of the phosphatidylinositolphosphate biosynthetic pathway. We found that c-Fos activates CDP-diacylglycerol synthase and phosphatidylinositol (PtdIns) 4-kinase II α in vitro, whereas no activation of phosphatidylinositol synthase or of PtdIns 4-kinase II β was observed. Both coimmunoprecipitation and fluorescence resonance energy transfer experiments consistently showed a physical interaction between the N-terminal domain of c-Fos and the enzymes it activatesFil: Alfonso Pecchio, Adolfo Rafael. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Cardozo Gizzi, Andres Mauricio. Instituto Universitario de Ciencias Biomédicas de Córdoba; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Renner, Marianne L.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Molina Calavita, María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Caputto, Beatriz Leonor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

The catalytic efficiency of Lipin 1beta increases by physically interacting with the protooncoprotein c-Fos

Phosphatidic acid (PA) is a central precursor for membrane phospholipid biosynthesis. Lipin family is a Mg-dependent type I PA phosphatase,involved in de novo synthesis of neutral lipids and of phospholipids. The regulation of Lipin activity may govern the pathways by which these lipids aresynthesized and control the cellular levels ofimportant signaling lipids. On the other hand, the proto-oncoprotein c-Fos has an emerging role in glycerolipid synthesis regulation: by interacting with key synthetizing enzymes it is able toincrease overall phopho- and glyco- lipid synthesis.We studied the Lipin 1β enzyme activity in a cell-free system using PA/Triton X-100 mixed micelles as substrate, analyzing it in the presence/absence of c-Fos. We found that Lipin 1β kcat increases around 40% in the presence of c- Fos, with no change in the Lipin 1β affinity for the PA/Triton X-100 mixed micelles. We also probed a physical interaction between both proteins. While the c-Fos domain involved in Lipin activation is its basic domain (BD), the interaction domain is mapped to the c-Fos N-terminal. In conclusion, we provide evidence for a novel positive regulator of Lipin 1β PA phosphatase activity that is not achieved via altering its subcellular localization or affinity for membranesbut rather through directly increasing its catalytic efficiency.Fil: Cardozo Gizzi, Andres Mauricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones En Química Biológica de Córdoba (p); ArgentinaFil: Prucca, Cesar German. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones En Química Biológica de Córdoba (p); ArgentinaFil: Gaveglio, Virginia Lucía. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Bahia Blanca. Instituto de Investigaciones Bioquímicas Bahia Blanca (i); ArgentinaFil: Renner, Marianne L.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (p); ArgentinaFil: Pasquaré, Susana J.. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Bahia Blanca. Instituto de Investigaciones Bioquímicas Bahia Blanca (i); ArgentinaFil: Caputto, Beatriz Leonor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones En Química Biológica de Córdoba (p); Argentin