Development of biotechnological strategies for in vitro generation of erythroid cells from hematopoietic stem/progenitor cells derived from umbilical cord blood

Fil: Cappellino, Luisina Anabel. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina.Las células del linaje eritroide tienen potencial aplicación en terapia celular, entrega y análisis de drogas e identificación de pares de transfusión e individuos aloinmunizados. Actualmente su producción ex vivo a partir de células madre hematopoyéticas (HSPCs) no es rentable, lo que impide su empleo en transfusiones y limita otros usos. El objetivo fue desarrollar estrategias para generar células eritroides a partir de HSPCs de sangre de cordón umbilical, reduciendo el uso de factores de crecimiento, principales contribuyentes al costo del medio de cultivo. Se aplicaron diseños experimentales para optimizar la formulación del medio de expansión de HSPCs. Un diseño Placket-Burman permitió determinar efectos significativos de la BSA, GM-CSF e hidrocortisona. Sus concentraciones óptimas fueron 2%(P/V), 20 ng/ml y 0,00004 M, respectivamente, aplicando un diseño Box‑Behnken. Se cultivaron HSPCs en estas condiciones y luego en medio reportado de expansión/maduración eritroide. Se evidenció expansión y diferenciación eritroide progresiva y selectiva, mediante análisis inmunofenotípico, morfológico y UFC. Adicionalmente, se hipotetizó que la transgenesis lentiviral con el gen de hEPO permitiría que las células la produzcan, disminuyendo su utilización como suplemento. Tanto las HSPCs transducidas cultivadas sin EPO comercial [eHSPCs-EPOc(-)], como aquéllas no modificadas cultivadas con EPOc [nmHSPCs-EPOc(+)] alcanzaron similar maduración, con compromiso eritroide, evidenciado por un incremento de células CD71+ y CD235a+ y cambios morfológicos. La detección de hEPO secretada en sobrenadantes de eHSPCs-EPOc(-) demostró que ésta indujo la diferenciación. Además las nmHSPCs‑EPOc(-) no mostraron compromiso eritroide. Ambas estrategias son intersantes para mejorar los procesos de producción ex vivo de células eritroides.Erythroid lineage cells have potential application in cell therapy, drug delivery and screening, and identification of transfusion matches or alloimmunized individuals. However, the available protocols for their ex vivo production from hematopoietic stem cells (HSPCs) are not cost-effective, which prevents their utilization in transfusional practices and limits other uses. The aim was to develop strategies to generate erythroid cells from umbilical cord blood HSPCs, reducing growth factors utilization, as they are the main contributors to the culture medium cost. Experimental designs were applied to optimize the HSPCs expansion medium formulation. Plackett-Burman design allowed identifying that BSA, GM-CSF and hydrocortisone have significant effects over expansion. Their optimal concentrations were 2%(W/V), 20 ng/ml and 0,00004 M, respectively, after applying a Box-Behnken design. After expansion in these conditions, HSPCs were cultured in a reported erythroid expansion/maturation medium. 571-fold expansion and progressive and selective erythroid differentiation were evidenced by immunophenotypic, morphological, hemoglobin and CFU analyses. Additionally, it was hypothesized that lentiviral transgenesis with the erythropoietin (hEPO) gene would make cells produce hEPO, diminishing its utilization as supplement. Both transduced HSPCs cultured without commercial EPO [eHSPCs-EPOc(-)] and non-modified cells cultured with EPOc [nmHSPCs-EPOc(+)], reached similar maturation states, with erythroid commitment, as percentages of CD71+ and CD235a+ cells increased and morphological changes were evidenced. eHSPCs-EPOc(-) differentiation was shown to be induced by secreted hEPO, which was detected by ELISA and western blotting. Furthermore, nmHSPCs-EPOc(-) controls did not show erythroid commitment. Both approaches are interesting to improve the biotechnological processes intended for ex vivo erythroid cells production.Universidad Nacional del LitoralConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnica

Strategy for erythroid differentiation in ex vivo cultures: Lentiviral genetic modification of human hematopoietic stem cells with erythropoietin gene

If cultured in appropriate conditions, such as supplementing culture media with costly cytokines and growth factors, hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) from different origins have shown to be an adequate source of erythroid cells. This requirement turns erythroid cells production into a complicated process to be scaled-up for future applications. The aim of our work was to genetically modify HSPCs with human erythropoietin (hEPO) sequence by lentiviral transgenesis in order for cells to secrete the hormone into the culture medium. Initially, we evaluated erythroid differentiation in colony forming units (CFU) assays and further analyzed cell expansion and erythroid differentiation throughout time in suspension cultures by flow cytometry and May-Grünwald-Giemsa staining. Additionally, we studied hEPO production and its isoforms profile. The different assessment approaches demonstrated erythroid differentiation, which was attributed to the hEPO secreted by the HSPCs. Our data demonstrate that it is possible to develop culture systems in which recombinant HSPCs are self-suppliers of hEPO. This feature makes our strategy attractive to be applied in biotechnological production processes of erythroid cells that are currently under development.Fil: Cappellino, Luisina Anabel. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Kratje, Ricardo Bertoldo. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Etcheverrigaray, Marina. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Prieto, Claudio. Universidad Nacional del Litoral; Argentin

Introducción a la Biotecnología: Sus aplicaciones y alcances

Durante el periodo en que duró la pandemia de Covid?19 pudimos visualizar que se ha hecho evidente la importancia de la Ciencia en general y de la Biotecnología en particular para lidiar con un enemigo devastador. Los científicos especializados en Biotecnología salieron a dar respuestas y soluciones urgentes para aminorar los efectos nefastos de la pandemia. ¿Qué es y por qué es tan importante la Biotecnología en nuestras vidas? El concepto de Biotecnología es muy amplio e incluye a toda tecnología que utiliza seres vivos para producir un bien. Manejar, dominar e innovar en Biotecnología requiere de conocimientos en Biología, Bioquímica, Genética y otras disciplinas relacionadas. ¿Cuáles son los desafíos? Entre otros, generar mayor productividad agrícola con menor huella ambiental, generar más y mejores medicamentos, desarrollar métodos preventivos, de diagnóstico, reemplazar los productos tóxicos por bioproductos amigables con el ambiente y tantos otros que surgirán en el futuro cercano. ¿Cómo se generan esas soluciones? Empezando por hacer las preguntas básicas de la Biología e investigando a nivel fundamental cómo funcionan las cosas, qué mecanismos moleculares están en juego, qué genes participan, etcétera. Responder a esas preguntas requiere indiscutiblemente de la aplicación del método científico: observación, hipótesis, experimentación, teoría. Hay una sola Ciencia, la que se hace bien siguiendo el método científico.Fil: Attallah, Carolina Veronica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Burns, Patricia Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Lactología Industrial. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería Química. Instituto de Lactología Industrial; ArgentinaFil: Cabello, Julieta Virginia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Campi, Mabel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Cappellino, Luisina Anabel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Universidad Nacional del Litoral; Argentina. Inserm; FranciaFil: Caputto, María Carolina. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Cardozo, María Alejandra. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Colombatti, Francisco. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Universidad Nacional del Litoral; Argentina. Molinos Agro. San Lorenzo; ArgentinaFil: Comelli, Raul Nicolas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Follonier, Adriana Mabel. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Fontana, Diego Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Fuselli, Antonela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Laboratorio de Cultivos Celulares; ArgentinaFil: Gaydou, Luisa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; ArgentinaFil: Gerard, Matias Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Investigación en Señales, Sistemas e Inteligencia Computacional. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería y Ciencias Hídricas. Instituto de Investigación en Señales, Sistemas e Inteligencia Computacional; ArgentinaFil: Gugliotta, Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Hick, Emilia Liza. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Lactología Industrial. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería Química. Instituto de Lactología Industrial; ArgentinaFil: Luque, María Victoria. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Mercanti, Diego Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Lactología Industrial. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería Química. Instituto de Lactología Industrial; ArgentinaFil: Muriel, Andrés. PathoNext GmbH; AlemaniaFil: Prieto, Claudio César. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Raineri, Jesica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Ramos, Jorge Guillermo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; ArgentinaFil: Ré, Delfina Adela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Reidel, Ivana Gabriela. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ciencias Agropecuarias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Reyes, Marcos Adrián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; ArgentinaFil: Russi, Romina Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Medicina y Biología Experimental de Cuyo; ArgentinaFil: Tosolini, Ileana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Trombert, Alejandro Raul. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Tschopp, María Virginia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Cátedra de Fisiología Humana; Argentin