Are Orai1 and Orai3 channels more important than calcium influx for cell proliferation?

AbstractTransformed and tumoral cells share the characteristic of being able to proliferate even when external calcium concentration is very low. We have investigated whether Human Embryonic Kidney 293 cells, human hepatoma cell Huh-7 and HeLa cells were able to proliferate when kept 72h in complete culture medium without external calcium. Our data showed that cell proliferation rate was similar over a range of external calcium concentration (2μM to 1.8mM). Incubation in the absence of external calcium for 72h had no significant effect on endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ contents but resulted in a significant decrease in cytosolic free calcium concentration in all 3 cell types. Cell proliferation rates were dependent on Orai1 and Orai3 expression levels in HEK293 and HeLa cells. Silencing Orai1 or Orai3 resulted in a 50% reduction in cell proliferation rate. Flow cytometry analysis showed that Orai3 induced a small but significant increase in cell number in G2/M phase. RO-3306, a cdk-1 inhibitor, induced a 90% arrest in G2/M reversible in less than 15min. Our data showed that progression through G2/M phase after release from RO-3306-induced cell cycle arrest was slower in both Orai1 and Orai3 knock-downs. Overexpressing Orai1, Orai3 and the dominant negative non-permeant mutants E106Q-Orai1 and E81Q-Orai3 induced a 50% increase in cell proliferation rate in HEK293 cells. Our data clearly demonstrated that Orai1 and Orai3 proteins are more important than calcium influx to control cell proliferation in some cell lines and that this process is probably independent of ICRAC and Iarc

Bi-allelic loss-of-function OBSCN variants predispose individuals to severe recurrent rhabdomyolysis

Rhabdomyolysis is the acute breakdown of skeletal myofibres in response to an initiating factor, most commonly toxins and over exertion. A variety of genetic disorders predispose to rhabdomyolysis through different pathogenic mechanisms, particularly in patients with recurrent episodes. However, most cases remain without a genetic diagnosis. Here we present six patients who presented with severe and recurrent rhabdomyolysis, usually with onset in the teenage years; other features included a history of myalgia and muscle cramps. We identified 10 bi-allelic loss-of-function variants in the gene encoding obscurin (OBSCN) predisposing individuals to recurrent rhabdomyolysis. We show reduced expression of OBSCN and loss of obscurin protein in patient muscle. Obscurin is proposed to be involved in sarcoplasmic reticulum function and Ca2+ handling. Patient cultured myoblasts appear more susceptible to starvation as evidenced by a greater decreased in sarcoplasmic reticulum Ca2+ content compared to control myoblasts. This likely reflects a lower efficiency when pumping Ca2+ back into the sarcoplasmic reticulum and/or a decrease in Ca2+ sarcoplasmic reticulum storage ability when metabolism is diminished. OSBCN variants have previously been associated with cardiomyopathies. None of the patients presented with a cardiomyopathy and cardiac examinations were normal in all cases in which cardiac function was assessed. There was also no history of cardiomyopathy in first degree relatives, in particular in any of the carrier parents. This cohort is relatively young, thus follow-up studies and the identification of additional cases with bi-allelic null OBSCN variants will further delineate OBSCN-related disease and the clinical course of disease. Cabrera-Serrano et al. show that biallelic loss-of-function variants in the gene encoding obscurin (OBSCN) predispose individuals to recurrent and severe episodes of rhabdomyolysis, typically with onset in the teenage years.Peer reviewe

Implication des canaux calciques TRP dans les phénomènes de prolifération hépatocytaire

Les cellules des vertébrés ont développé un système intracellulaire de régulation qui utilise les ions calciques (Ca2+) pour contrôler de nombreux phénomènes physiologiques tels la prolifération cellulaire. Le fait que la croissance cellulaire dépende du Ca2+ extracellulaire suggère que l'entrée de Ca2+ joue un rôle important lors des événements mitogéniques. L'exacte nature moléculaire des canaux impliqués dans cette entrée reste encore matière à débats. Les gènes des canaux TRP (Transient Receptor Potential) encodent pour une vingtaine de canaux plus ou moins sélectifs au calcium. La sous-famille des TRPC comprend 6 membres chez l'homme dont certains, comme TRPC1 et TRPC6, ont déjà été impliqués dans les phénomènes de prolifération (Golovina, Platoshyn et al. 2001; Sweeney, Yu et al. 2002). Le criblage des ADNc codant pour les TRP dans des foies sains et tumoraux, chez l'homme et chez la souris, nous a permis de déterminer que TRPC6 est plus particulièrement impliqué dans les phénomènes de prolifération dans ce tissu. Nous avons développé un anticorps spécifique afin de suivre l'expression et la localisation de la protéine TRPC6. Chez la souris XVIInc/Z, l'induction chimique de tumeurs hépatiques, s'accompagne de l'expression du canal membranaire TRPC6 au niveau de la zone tumorale. L'étude des courbes de croissance de différentes lignées surexprimant stablement le canal TRPC6, l'utilisation de petits ARN interférents dirigés contre TRPC6 et la mesure de l'entrée de calcium dans ces conditions, nous ont permis de définir la relation entre influx calcique et prolifération cellulaire. Ces travaux montrent que le canal TRPC6 humain est un acteur de l'entrée capacitative, elle-même impliquée dans les phénomènes de prolifération hépatocytaire.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Rôle des canaux calciques de la membrane plasmique dans la prolifération des cellules tumorales hépatiques

La tumeur maligne primitive du foie la plus fréquente est le carcinome hépatocellulaire. Le développement des cellules tumorales hépatiques dépend d'un influx calcique dont la base moléculaire, dans le foie, est constituée de TRPC6, des STIM1 et 2, et de Orai1. Nous avons recherché si le développement de ces tumeurs était accompagné d'un changement du profil d'expression de ces protéines. Nous avons montré que le canal TRPC6 est absent des hépatocytes humains sains mais fortement exprimé dans les tumeurs hépatiques, les foyers d'expression de TRPC6 étant visibles uniquement dans les zones tumorales du foie. Le niveau d'expression de TRPC6 dépend de certains facteurs de croissance et cette expression est directement corrélée à l'amplitude de l'entrée de calcium et à la prolifération cellulaire des hépatomes humains. STIM1 et Orai1 sont aussi impliqués dans cette relation, l'inhibition de l'expression de TRPC6, STIM1 ou Orai1 entraînant une baisse de l'expression des cyclines D1 dans ces cellules. Inversement, le blocage du cycle cellulaire va entraîner, de manière réversible (<4heures), une importante réduction de l'entrée de calcium. Les cultures primaires d'hépatocytes humains nous ont permis de confirmer ces résultats, démontrant ainsi la relation étroite entre entrée calcique et prolifération cellulaire. Nos derniers résultats ont montré que la base moléculaire de cette entrée dépend du type cellulaire utilisé mais que Orai1 en est la pièce centrale. Ce travail de thèse a permis d'élargir les connaissances sur la composition du complexe moléculaire formant l'entrée calcique directement impliquée dans la prolifération cellulaire et le développement de tumeurs hépatiques.Hepatocellular carcinoma is the most frequent primary liver tumor. Tumoral cell proliferation depends on calcium influx which molecular basis in human liver is formed of TRPC6, STIM1 and 2, and Orai1. We have investigated whether tumors' development in human livers was accompanied by a change in the pattern of expression of these proteins. We have shown that TRPC6 channel is absent in healthy human hepatocytes but strongly expressed in human liver tumors, and TRPC6 expression is only detectable in the tumor zones. TRPC6 expression level depends on growth factors, and this expression is directly correlated with the amplitude of the calcium entry and cell proliferation of human hepatoma cell line. STIM1 and Orai1 also play a major role in this process and inhibition of the expression of TRPC6, STIM1 or Orai1 causes a decrease in cyclin D1 expression in human hepatoma cell line. Conversely, cell cycle block results in a large decrease in calcium influx that quickly reversed in less than 4 hours after cell cycle release. Primary cultures of human hepatocytes allowed us to confirm these results, emphasizing the tight relation between calcium influx and cell proliferation. Our recent data strongly suggested that the molecular basis of this calcium entry varies from one cell type to another, with Orai1 as the core of this plasma membrane complex. In conclusion, this thesis has expanded the knowledge about the actors of calcium entry and their role in the proliferation of both liver cells and liver cancer developmentLILLE1-Bib. Electronique (590099901) / SudocSudocFranceF

Immunodéficiences et pathologies associées aux mutations dans STIM/ORAI

Sous l’effet de divers stimulus, l’efflux du calcium (Ca2+) stocké dans le réticulum endoplasmique induit l’ouverture de canaux calciques spécifiques à la surface membranaire cellulaire selon un processus appelé entrée capacitative du Ca2+. Le Ca2+ extracellulaire entre alors massivement dans la cellule, participe à la signalisation et remplit à nouveau les stocks. Il y a cinq ans, la découverte des protéines STIM1 et ORAI1 a permis de révéler qu’elles forment la base moléculaire des canaux calciques impliqués dans l’entrée capacitative du Ca2+. La découverte de mutations dans ORAI1 ou dans STIM1 chez des patients présentant un déficit immunitaire associé à des manifestations extra-hématopoïétiques (myopathie) a contribué à la mise en évidence de ce couple. Depuis lors, la liste sans cesse croissante de protéines partenaires de STIM1 et ORAI1 et des nouvelles pathologies associées à leurs mutations leur confère un rôle central dans le contrôle de l’homéostasie calcique cellulaire