Isolamento, cultivo, caracterização e criopreservação de células tronco mesenquimais derivadas de membrana amniótica, geléia de Wharton e sangue do cordão umbilical de fetos bovinos

Stem cells are undifferentiated cells with a high proliferation potential. These cells can be characterized by their in vivo ability to self-renew and to differentiate into specialized cell lines. The most used stem cell type, in both human and veterinary field, is the mesenchymal stem cells (MSC). Nowadays, there is a great tendency to use stem cells derived from fetal tissues, such as amniotic membrane (AM), extravascular matrix of umbilical cord (EMUC) and umbilical cord blood (UCB), which can be obtained non-invasively at delivery time. Thus, the aim of this study was to isolate, characterize and differentiate. MSC derived from bovine fetal annexes cow dairy neonates after assisted delivery and of fetus obtained in slaughterhouse. Cells were isolated by enzymatic digestion of the tissue fragments with 0,1% collagenase solution. Six samples of AM and EMUC at delivery time, six samples of AM and EMUC at first third of pregnancy and six samples of UCB at secondary third of pregnancy were subjected to morphology evaluation, immunocytochemistry, flow cytometry and in vitro osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation. Moreover, sample were cryopresrved and evaluated for viability by flow citometri. All samples showed adherence to plastic and fibroblast-like morphology. Immunocytochemistry revealed expression of CD 44, NANOG and OCT-4 and lack of expression of MHC II in MSC from all samples. Flow cytometry demonstrated that cells from all samples expressed CD 44, lacked CD 34 expression and showed low expression of MHC II. They were also capable of trilineage mesenchymal differentiation and showed 80-90% viability after cryopreservation. According to the results, AM, EMUC and UCB, either obtained at delivery time or from slaughterhouse, are a painless and non-invasive source of MSC and can be used for stem cell bank creationAs células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplicação, o que as tornam muito atrativas para a terapia celular, tanto na medicina humana como na medicina veterinária . Quando cultivadas in vitro são capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. Atualmente há uma grande tendência para a utilização de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cordão umbilical (CU) e sangue do cordão umbilical (SCU), podendo ser obtidas no momento do parto por uma técnica não invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA, CU e SCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e em abatedouro. As células foram recuperadas por meio de digestão enzimática tecidual, realizada com solução de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e CU no momento do parto (n=6) e de MA e CU no terço inicial de gestação (n=6), bem como de SCU no terço médio de gestação em abatedouro (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e diferenciações in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e criopreservação. Além disso, foram criopreservadas e analisadas por citometria de fluxo para observação da viabilidade celular. Todas as amostras dos diferentes períodos gestacionais demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marcação para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marcação para CD44, ausência de marcação para CD34 e baixa expressão de MHC II. Apresentaram também capacidade de diferenciação in vitro nas três linhagens mesodermais e quando analisadas ...Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Anexos fetais: uma fonte alternativa de células-tronco mesenquimais para a medicina veterinaria equina

The horse breeding industry has an important role in the Brazilian agribusiness generating wealth and many direct and indirect jobs. For this reason, the scientific research for the development of Brazilian horse production has reflected the current trend leading to studies focusing on sports medicine, neonatology and biotechnology of reproduction. Thus, in the last decade, the study of stem cells has come in scope to equine medicine primarily for the treatment of osteoarticular and musculoskeletal injuries of athletic horses, because it’s high potential for application in veterinary regenerative medicine. Stem cells (SC) can be classified by degree of potential as totipotent, pluripotent, multipotent and unipotent, and by its origin as embryonic or somatic. Complications of the therapeutic use of embryonic SCs leaded to the identification of several sources of adult stem cells, as the hematopoietic SC and mesenchymal SC. The most common source of mesenchymal stem cells (MSCs) is bone marrow, however, as their number and differentiation capacity decrease with age, their therapeutic potential also declines with time. Because of these limitations other sources of mesenchymal stem cells were identified, and the cells derived from fetal annexes have received much attention. MSCs derived from amniotic fluid, amniotic membrane and umbilical cord blood and tissue have been isolated and characterized showing many advantages in its use, such as non-invasive, painless collection and the possibility of formation of storage banks. In addition, there are many reports that MSCs derived from fetal annexes express embryonic markers such as Oct-4 and Nanog, which demonstrates that these cells can maintain pluripotency characteristics of the tissue from which they arise. Recently, several studies using MSCs derived from fetal annexes of horses have been carried out with excellent results. This review aims to gather studies on mesenchymal stem cells derived from horse fetal annexes showing them as an alternative, ethical source, easy to obtain and with great advantages to be used in equine veterinary medicine.La cría de caballos tiene un papel importante en la agroindustria brasilera en la generación de divisas y varios puestos de trabajo directos e indirectos. Por esta razón, hoy en día la investigación científica para el desarrollo de la producción brasilera equina refleja la tendencia actual elaborando estudios con énfasis en medicina deportiva, neonatología y biotecnología de la reproducción. Por lo tanto, en la última década ha surgido un grande interés en el estudio de células madre para la medicina equina principalmente para el tratamiento de lesiones osteoarticulares y músculo esquelético de los caballos deportivos, debido a su alto potencial para aplicación en medicina regenerativa veterinaria. Las células madre (CM) se pueden clasificar por su grado de potencialidad como unipotentes, totipotentes, pluripotentes y multipotentes, y cuanto a su origen como embrionarias o somáticas. Las complicaciones del uso terapéutico de CM embrionarias llevaron a la identificación de varias fuentes de células madre adultas, entre estas las CMs hematopoyéticas y mesenquimales. La fuente más común de células madre mesenquimales (MSC) es la médula ósea, sin embargo, como el número y capacidad de diferenciación de estas células disminuye con la edad, su potencial terapéutico también se reduce con el tiempo. Debido a estas limitaciones otras fuentes de células madre mesenquimales fueron identificados, y las células derivadas de los anexos fetales han recibido mucha atención. CMMs derivados de líquido amniótico, membrana amniótica, sangre del cordón umbilical y tejido de cordón umbilical humano fueron aisladas y caracterizadas mostrando muchas ventajas en su uso, tales como la recogida no invasiva y sin dolor, y la posibilidad de formación de bancos de almacenamiento. Además, hay muchos informes de que las CMMs derivadas de los anexos fetales expresan marcadores embrionarios, como Oct-4 y Nanog, lo que demuestra que estas células pueden mantener las características de pluripotencialidad de los tejidos de donde provienen. Recientemente, la investigación con CMMs derivadas de anexos fetales de equinos están siendo hechas y están obteniendo excelentes resultados. Esta revisión pretende reunir a los estudios sobre células madre mesenquimales procedentes de los anexos fetales muestrando como una fuente alternativa, ética, de fácil obtención y con grandes ventajas en su uso en medicina veterinaria equina.A equideocultura tem um papel importante no agronegócio brasileiro gerando divisas e diversos empregos diretos e indiretos. Por este motivo, a pesquisa científica em prol do desenvolvimento da produção eqüina brasileira tem refletido a tendência atual induzindo estudos principalmente nas áreas de medicina esportiva, neonatologia e biotecnologias da reprodução. Assim, na última década surgiu um grande interesse no estudo das células-tronco para a medicina eqüina principalmente para o tratamento das lesões musculoesqueléticas e osteoarticulares dos cavalos atletas, pelo seu alto potencial de aplicação na medicina veterinária regenerativa. As células-tronco (CT) podem ser classificadas quanto seu grau de potencialidade como totipotentes, pluripotentes, multipotentes e unipotentes, e quanto a sua origem como embrionárias ou somáticas. As complicações do uso terapêutico das CTs embrionárias levaram à identificação de diversas fontes de células-tronco adultas, entre estas as CT hematopoiéticas e CTs mesenquimais. A fonte mais utilizada de células-tronco mesenquimais (CTM) é a medula óssea, no entanto, como o seu número e a capacidade de diferenciação destas células diminuem com a idade, seu potencial terapêutico também declina com o tempo. Devido a estas limitações outras fontes de células-tronco mesenquimais foram identificadas, sendo que as células derivadas dos anexos fetais têm recebido bastante destaque. CTMs derivadas do líquido amniótico, membrana amniótica, sangue do cordão umbilical e tecido de cordão umbilical humanos já foram isoladas e caracterizadas demonstrando muitas vantagens em sua utilização, como a coleta não invasiva e indolor, e a possibilidade de formação de bancos de armazenamento. Além disso, existem muitos relatos de que as CTMs derivadas de anexos fetais expressam marcadores embrionários como o Oct- 4 e o Nanog, o que demonstra que estas células podem manter características de pluripotência dos tecidos de onde se originam. Recentemente, pesquisas com CTMs derivadas dos anexos fetais de eqüinos têm sido realizadas e vêm obtendo excelentes resultados. Esta revisão de literatura tem como objetivo reunir os estudos sobre as células-tronco mesenquimais com origem nos anexos fetais demonstrando-as como uma fonte alternativa, ética, de fácil obtenção e com grandes vantagens em sua utilização na medicina veterinária eqüina