The role of necroptotic extracellular vesicles in NAFLD pathogenesis

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.As vesículas extracelulares (EVs), envolvidas na comunicação intercelular e a necroptose, uma via de necrose regulada, cuja maquinaria facilita o tráfico endosomal e a geração de EVs, foram recentemente implicadas na patogénese de fígado gordo não alcoólico (NAFLD). Neste trabalho tivemos como objetivo caracterizar o papel funcional da maquinaria necroptótica na geração de EVs provenientes de hepatócitos (Hep-EVs) e o seu impacto na função dos hepatócitos com sobrecarga lípidica. Hep-EVs foram isoladas por precipitação a partir de células AML12 wild-type (WT), deficientes em Ripk3 e em Mlkl na presença ou ausência de 125 µM ácido palmítico (PA) durante 24h, sendo depois caracterizadas por immunoblotting e análise de rastreamento de nanoparticulas. De seguida, após 1h de pré-exposição a 10 µg/mL Hep-EVs, os hepatócitos foram incubados com 125 µM PA por 48h, seguido de avaliação da morte celular e do metabolismo lípidico. Os nossos resultados mostram que a incubação com PA aumenta a secreção de Hep-EVs, um fenótipo que é dependente da maquinaria necroptótica. Em contraste com os hepatócitos Mlkl-/-, os hepatócitos Ripk3-/- estiveram protegidos da morte celular provocada pelo PA, a qual por sua vez não foi afetada pela exposição a EVs. Ainda assim, as EVs derivadas de células WT tratadas com PA aumentaram ainda mais os níveis de RIPK3 em células WT tratadas com PA, um efeito que foi anulado pela deficiência em Ripk3. De igual modo, embora os hepatócitos Ripk3-/- tenham uma expressão aumentada de enzimas lipogénicas, estas células apresentaram menor acumulação lipídica, a qual foi ainda mais reduzida pela incubação com Ripk3-/- Hep-EVs. Este efeito foi concomitante com o aumento da expressão de marcadores de β-oxidação e autofagia. Por fim, as células Ripk3-/- apresentam níveis diminuídos de NLRP3 e Tgf-β, indicando que a RIPK3 pode regular a ativação do inflamassoma e a sinalização profibrogénica após sobrecarga lipídica. Em conclusão, a deficiência em Ripk3 protegeu os hepatócitos da lipotoxicidade, acompanhada pela redução da expressão de mediadores pró-inflamatórios e fibrogénicos, bem como alterações no metabolismo lipídico. Além disso, EVs necroptóticos podem ter um papel na comunicação hepatocelular, particularmente afetando o metabolismo lipídico e os níveis de RIPK3 nos hepatócitos vizinhos, provavelmente contribuindo para a patogénese de NAFLD.Both extracellular vesicles (EVs) involved in intercellular communication and necroptosis, a regulated necrotic cell death routine whose machinery facilitates endosomal trafficking and EV generation have been implicated in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Here, we aimed to elucidate the functional role of the necroptotic machinery in the generation of hepatocyte-derived EVs (Hep-EVs) and their implication in hepatocellular function after fat overload. Hep-EVs were isolated by precipitation from wild-type (WT) receptor-interacting protein kinase 3 (Ripk3)-deficient and mixed lineage kinase domain-like protein (Mlkl)-deficient AML-12 cells in the presence or absence of 125 µM palmitic acid (PA) for 24h, after which they were characterized by immunoblotting and nanoparticle tracking analysis. Then, after 1h pre-treatment with Hep-EVs (10 μg protein/mL), hepatocytes were exposed to 125 µM PA for 48h, followed by biochemical assessment of cell death and lipid metabolism. Our results showed that PA increases the secretion of Hep-EVs, a phenotype dependent on the necroptotic machinery. In contrast to Mlkl-/- hepatocytes, Ripk3-/- hepatocytes were protected from PA-induced cell death, which in turn was not affected by Hep-EV exposure. Still, PA-treated WT cell-derived EVs further increased RIPK3 protein levels in PA-treated WT cells, an effect that was abrogated by Ripk3 deficiency. Similarly, although Ripk3-/- hepatocytes display increased expression of the de novo lipogenesis enzymes, these cells displayed lower levels of fat accumulation, which were further decreased following incubation with Ripk3-/- Hep-EVs. This effect was concomitant with increased expression of β-oxidation and autophagy markers. Lastly, we showed that Ripk3-/- hepatocytes displayed decreased levels of NLRP3 and transforming growth factor-β, indicating that RIPK3 may regulate inflammasome activation and pro-fibrogenic signaling upon fat overload. In conclusion, Ripk3 deficiency protected hepatocytes from lipotoxicity, accompanied by reduced expression of proinflammatory and profibrogenic mediators, as well as changes in lipid metabolism. Further, necroptotic EVs may have a role in hepatocellular communication, particularly by affecting lipid metabolism and RIPK3 levels in neighbouring hepatocytes, likely contributing to NAFLD pathogenesis.Instituto de Investigação do Medicamento (iMed.ULisboa)