Carbapenen resistance and susceptible to broad spectrum cephalosporins in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates: evaluation of mechanisms of resistance involved

Objetivo: Esse estudo teve como objetivo avaliar os mecanismos de resistencia em isolados clinicos de P. aeruginosa que apresentavam fenotipo de resistencia aos carbapenens e sensibilidade as cefalosporinas de amplo espectro. Material e Metodos: Foram estudados 25 isolados de P. aeruginosa recuperadas de diferentes sitios infecciosos em tres distintos hospitais da cidade de São Paulo. Os isolados foram submetidos ao teste de sensibilidade antimicrobiana por microdiluicao em caldo (CLSI-2013). A similaridade genetica foi avaliada pela tecnica de PFGE, e a atividade enzimatica das carbapenemases foi avaliada pelo metodo de hidrolise enzimatica e MALDI-TOF. A pesquisa de genes que codificam as β-Lactamases foi realizada pela tecnica da PCR, seguido por sequenciamento. A desrrepressao de ampC e a hiperexpressao dos sistemas de efluxo foram avaliados fenotipicamente pela adicao de seus inibidores (cloxacilina e PAβN, respectivamente). A transcricao dos genes mexB, mexD, mexF e mexY, da β-lactamase cromossomal ampC e da porina oprD foi avaliada pela tecnica de qRT-PCR. As proteinas de membrana externa foram avaliadas pela tecnica de SDS-PAGE e em seguida foi realizada a tecnica da PCR. A resistencia aos aminoglicosideos e ao ciprofloxacino foi avaliada pela a tecnica da PCR, seguida por sequenciamento dos respectivos genes responsaveis por conferirem resistencia a estes antimicrobianos. Resultados: O fenotipo de resistencia a pelo menos um dos carbapenens (imipenem e meropenem) e sensibilidade as cefalosporinas de amplo espectro (cefepima e ceftazidima) foi confirmado em todos isolados clinicos estudados. A resistencia a ciprofloxacina e aos aminoglicosideos foi observada em cinco (20%) e dois (8%) desses isolados, respectivamente. A analise do perfil eletroforetico por PFGE permitiu o agrupamento dos isolados estudados em 17 padroes distintos sem a predominancia de um perfil clonal. Nenhum isolado apresentou atividade carbapenemase no teste de hidrolise, no entanto, no MALDI-TOF quatro isolados apresentaram resultados duvidosos. Porem, a pesquisa de genes codificadores de carbapenemases conhecidas foi negativa. Os genes cromossomais, blaampC e blaOXA-50 foram amplificados entre as amostras estudadas e seu sequenciamento revelou diversas mutacoes no gene blaOXA-50. O gene blaOXA-56 estava presente em um isolado. A inibicao in vitro da AmpC cromossomal e da expressao dos sistemas de efluxo produziu uma variacao de ≥ 2 diluicoes na CIMs dos antimicrobianos testados para a maioria dos isolados testados. A media da expressao relativa dos genes mexB, mexD, mexF e mexY nas 25 amostras de P. aeruginosa foram 1,92; 2,69; 6,04 e 1,56, respectivamente, em relacao a cepa referencia PAO1. A β-lactamase AmpC estava hiperexpressa em 40% dos isolados de P. aeruginosa, enquanto todos os isolados tiveram reducao da expressao de OprD. Uma alteracao na banda de 46 kDa foi identificada pelo SDS-PAGE em todos isolados clinicos estudados. Os cinco isolados resistentes a ciprofloxacina apresentaram mutacao na QRDR dos genes gyrA e parC e apenas um dos isolados resistentes aos aminoglicosideos carregava o gene de resistencia rmtD. Conclusao: Nossos resultados sugerem o envolvimento de multiplos mecanismos cromossomais, como a hiperexpressao da β-lactamase cromossomal AmpC e a reducao da expressao de OprD no fenotipo de resistencia aos carbapenens e sensibilidade as cefalosporinas de amplo espectro entre isolados clinicos de P. aeruginosaBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe