Avaliação da atividade de amicacina e polimixina B isoladamente e combinados com imipenem frente a isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico

Base teórica: Devido à diminuição do desenvolvimento de novos antimicrobianos nas últimas décadas, terapias combinadas têm sido empregadas contra bactérias multirresistentes como opção à monoterapia no tratamento de infecções graves. Para tratar infecções causadas por Peusdomonas aeruginosa resistente a carbapenêmicos, amicacina e polimixina B têm sido utilizadas em associações com imipenem, pois possuem diferentes mecanismos de ação, o que, teoricamente, indicaria a possibilidade de efeito sinérgico. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi verificar a interação, in vitro, de amicacina e polimixina B em associação com imipenem frente a diferentes isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico. Métodos: Foram selecionados isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, coletados no período de janeiro a março de 2015. Foi realizada eletroforese em gel de campo pulsado e detecção do gene blaSPM-1 para selecionar diferentes clones. Seis isolados (três SPM-1 positivos e três negativos para a carbapenemase) foram selecionados para realização da técnica de time-kill, a fim de avaliar a atividade antimicrobiana das combinações de imipenem com amicacina e imipenem com polimixina B. Resultados: Sinergismo ocorreu para combinações de imipenem com amicacina em 3 isolados, dos quais um era SPM-1 positivo e dois eram SPM-1 negativos e todos apresentaram CIMs relativamente baixas a intermediárias. Quanto às combinações de imipenem com polimixina B, houve sinergismo somente para dois isolados, um SPM-1 positivo e um SPM-1 negativo, contudo houve antagonismo em 5 isolados, dois SPM-1 positivos e três SPM-1 negativos. Para 4 isolados, as combinações de imipenem com amicacina tiveram atividade bactericida, enquanto, para todos os isolados, as combinações de imipenem com polimixina B, bem como polimixina B isoladamente, 1x e 2x a CIM apresentaram atividade bactericida. Conclusão: Sinergismo pode ocorrer, para combinações de imipenem mais amicacina, quando os isolados apresentam CIMs relativamente baixas ou intermediárias para imipenem (≤16 μg/mL a 128 μg/mL) e amicacina (≤32 μg/mL). Entretanto, antagonismo aconteceu independentemente de valores altos ou baixos de concentrações inibitórias mínimas para imipenem e polimixina B. Além disso, a presença ou ausência do gene blaSPM-1 não pareceu influenciar nos resultados.Background: Due to a decrease on new antibiotic development over the last decades, combined therapies have been employed against multigrug-resistant bacteria as an option to monotherapy in severe infection treatment. In order to treat infections caused by carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa, amikacin and polymyxin B have been used in associations with imipenem, because they possess different mechanisms of action, which could, theoretically, indicate the possibility of synergistic effect. Objective: The aim of this study was to verify the interaction, in vitro, of amikacin and polymyxin B in association with imipenem against various carbapenem resistant P. aeruginosa isolates. Methods: Carbapenem resistant P. aeruginosa isolates have been selected from Hospital de Clínicas de Porto Alegre, collected from January to March 2015. Pulsed field gel electrophoresis and detection of blaSPM-1 gene has been performed to select different clones. Six isolates (three SPM-1 positive and three negative for the carbapenemase) were selected for time-kill assay, in order to assess antimicrobial activity of imipenem plus amikacin and imipenem plus polymyxin B combinations. Results: Synergism occurred for combinations of imipenem plus amikacin in three isolates, from which one was SPM-1 positive and two were SPM-1 negative, and all presented relatively low to intermediate minimum inhibitory concentrations. About imipenem plus polymyxin B combinations, synergism occurred in only two isolates, one SPM-1 positive and one SPM-1 negative, however antagonism occurred in five isolates, two SPM-1 positive and three SPM-1 negative. For 4 isolates, imipenem plus amikacin combinations had bactericidal effect, while, for all isolates, combinations of imipenem plus 1x and 2x the MIC of polymyxin B presented bactericidal activity. Conclusions: Synergism can occur, for imipenem plus amikacin combinations, when isolates present relatively low or intermediate MIC of imipenem (≤16 μg/mL to 128 μg/mL) and amikacin (≤32 μg/mL). However, antagonism happened regardless high or low minimum inhibitory concentrations for imipenem and polymyxin B. Also, the presence or absence of blaSPM-1 gene did not seem to influence the results

Desenvolvimento de metodologias rápidas para detecção de mecanismos de resistência bacteriana e determinação da suscetibilidade a antimicrobianos em Enterobacterales por MALDI-TOF MS

Introdução: A demanda para a detecção rápida de mecanismos de resistência antimicrobiana e por métodos rápidos para a determinação da suscetibilidade aos antimicrobianos vem crescendo, especialmente devido ao aumento da prevalência de isolados de Enterobacterales produtores de carbapenemases KPC e/ou NDM. Com esta problemática em vista, a tecnologia de matrix-assisted laser desorption ionization – time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) vem se tornando uma opção de metodologia importante, pois permite o desenvolvimento de ensaios capazes de proverem um resultado rápido da presença de mecanismos de resistência e da suscetibilidade a antimicrobianos. Objetivo: Desenvolver metodologias rápidas para a detecção de mecanismos de resistência e para a determinação da suscetibilidade através da metodologia de MALDI-TOF MS. Métodos: Para a detecção de hidrólise por MALDI-TOF MS, as moléculas intactas de meropenem foram detectadas em um espectro de massa e relacionadas a um padrão interno de forma a calcular um índice quantitativo de hidrólise. Para a detecção da enzima KPC a partir de bactérias impregnadas em papel-filtro, uma suspensão bacteriana foi submetida a um protocolo de extração e posterior análise por MALDI-TOF MS, identificando o pico relativo à molécula intacta da enzima. Foi aplicada a metodologia MALDI Biotyper – antibiotic susceptibility test rapid assay (MBT-ASTRA), com simplificações, para a realização da avaliação da suscetibilidade a antimicrobianos a partir de colônias bacterianas, a partir de hemoculturas positivas e para a detecção de sinergismo. Resultados e conclusões: Um índice quantitativo para determinação da hidrólise ao meropenem foi desenvolvido, diferenciando Enterobacterales que possuíam os genes blaKPC ou blaNDM de isolados não produtores de carbapenemases. Foi possível identificar a enzima KPC de bactérias impregnadas em papel-filtro com alta especificidade, mas baixa sensibilidade. Foi possível desenvolver a técnica de MBT-ASTRA simplificada para determinação da suscetibilidade a meropenem a partir de colônia, para ceftazidima/avibactam e meropenem a partir de hemocultura e para a detecção de sinergismo da combinação de aztreonam e ceftazidima/avibactam.Background: The need for rapid detection of antimicrobial resistance mechanisms and for rapid methods to determine antimicrobial susceptibility has been growing, especially due to the increasing prevalence of KPC and/or NDM carbapenemase-producing Enterobacterales isolates. With this problem in mind, the matrix-assisted laser desorption ionization – time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology has become a valuable methodology because it allows the development of assays capable of providing a rapid result of the presence of resistance mechanisms and the antimicrobial susceptibility testing. Objective: To develop rapid methodologies for antimicrobial susceptibility testing and for detection of resistance mechanisms through MALDI-TOF MS methodology. Methods: For the detection of hydrolysis by MALDI-TOF MS, intact molecules of meropenem were detected in a mass spectrum e related to and internal standard in order to calculate a hydrolysis quantitative index. For the detection of KPC enzyme from bacteria impregnated in filter-paper, a bacterial suspension was submitted to an extraction protocol and subsequent analysis by MALDI-TOF MS, identifying the peak related to the enzyme intact molecule. MALDI Biotyper – antibiotic susceptibility test rapid assay (MBT-ASTRA) was used, with simplifications, to perform antimicrobial susceptibility testing from bacterial colonies, from positive blood cultures and for synergism detection. Results and conclusions: A quantitative index to determine meropenem hydrolysis was developed, differentiating Enterobacterales that had the blaKPC or blaNDM genes from non-carbapenemase-producing isolates. It was possible to identify the KPC enzyme from bacteria impregnated on filter-paper with high specificity, but low sensitivity. It was possible to develop the simplified MBT-ASTRA technique for determining susceptibility to meropenem from colony, to ceftazidime/avibactam and meropenem from blood culture and for synergism detection of aztreonam and ceftazidime/avibactam combination

Avaliação da atividade de amicacina e polimixina B isoladamente e combinados com imipenem frente a isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico

Base teórica: Devido à diminuição do desenvolvimento de novos antimicrobianos nas últimas décadas, terapias combinadas têm sido empregadas contra bactérias multirresistentes como opção à monoterapia no tratamento de infecções graves. Para tratar infecções causadas por Peusdomonas aeruginosa resistente a carbapenêmicos, amicacina e polimixina B têm sido utilizadas em associações com imipenem, pois possuem diferentes mecanismos de ação, o que, teoricamente, indicaria a possibilidade de efeito sinérgico. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi verificar a interação, in vitro, de amicacina e polimixina B em associação com imipenem frente a diferentes isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico. Métodos: Foram selecionados isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, coletados no período de janeiro a março de 2015. Foi realizada eletroforese em gel de campo pulsado e detecção do gene blaSPM-1 para selecionar diferentes clones. Seis isolados (três SPM-1 positivos e três negativos para a carbapenemase) foram selecionados para realização da técnica de time-kill, a fim de avaliar a atividade antimicrobiana das combinações de imipenem com amicacina e imipenem com polimixina B. Resultados: Sinergismo ocorreu para combinações de imipenem com amicacina em 3 isolados, dos quais um era SPM-1 positivo e dois eram SPM-1 negativos e todos apresentaram CIMs relativamente baixas a intermediárias. Quanto às combinações de imipenem com polimixina B, houve sinergismo somente para dois isolados, um SPM-1 positivo e um SPM-1 negativo, contudo houve antagonismo em 5 isolados, dois SPM-1 positivos e três SPM-1 negativos. Para 4 isolados, as combinações de imipenem com amicacina tiveram atividade bactericida, enquanto, para todos os isolados, as combinações de imipenem com polimixina B, bem como polimixina B isoladamente, 1x e 2x a CIM apresentaram atividade bactericida. Conclusão: Sinergismo pode ocorrer, para combinações de imipenem mais amicacina, quando os isolados apresentam CIMs relativamente baixas ou intermediárias para imipenem (≤16 μg/mL a 128 μg/mL) e amicacina (≤32 μg/mL). Entretanto, antagonismo aconteceu independentemente de valores altos ou baixos de concentrações inibitórias mínimas para imipenem e polimixina B. Além disso, a presença ou ausência do gene blaSPM-1 não pareceu influenciar nos resultados.Background: Due to a decrease on new antibiotic development over the last decades, combined therapies have been employed against multigrug-resistant bacteria as an option to monotherapy in severe infection treatment. In order to treat infections caused by carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa, amikacin and polymyxin B have been used in associations with imipenem, because they possess different mechanisms of action, which could, theoretically, indicate the possibility of synergistic effect. Objective: The aim of this study was to verify the interaction, in vitro, of amikacin and polymyxin B in association with imipenem against various carbapenem resistant P. aeruginosa isolates. Methods: Carbapenem resistant P. aeruginosa isolates have been selected from Hospital de Clínicas de Porto Alegre, collected from January to March 2015. Pulsed field gel electrophoresis and detection of blaSPM-1 gene has been performed to select different clones. Six isolates (three SPM-1 positive and three negative for the carbapenemase) were selected for time-kill assay, in order to assess antimicrobial activity of imipenem plus amikacin and imipenem plus polymyxin B combinations. Results: Synergism occurred for combinations of imipenem plus amikacin in three isolates, from which one was SPM-1 positive and two were SPM-1 negative, and all presented relatively low to intermediate minimum inhibitory concentrations. About imipenem plus polymyxin B combinations, synergism occurred in only two isolates, one SPM-1 positive and one SPM-1 negative, however antagonism occurred in five isolates, two SPM-1 positive and three SPM-1 negative. For 4 isolates, imipenem plus amikacin combinations had bactericidal effect, while, for all isolates, combinations of imipenem plus 1x and 2x the MIC of polymyxin B presented bactericidal activity. Conclusions: Synergism can occur, for imipenem plus amikacin combinations, when isolates present relatively low or intermediate MIC of imipenem (≤16 μg/mL to 128 μg/mL) and amikacin (≤32 μg/mL). However, antagonism happened regardless high or low minimum inhibitory concentrations for imipenem and polymyxin B. Also, the presence or absence of blaSPM-1 gene did not seem to influence the results

Evaluation of Aztreonam and Ceftazidime/Avibactam Synergism against <i>Klebsiella pneumoniae</i> by MALDI-TOF MS

Introduction: Resistance to carbapenems due to the co-production of NDM and ESBL or NDM and KPC is increasing. Therefore, combined therapy with aztreonam (ATM) plus ceftazidime/avibactam (CZA) has been recommended. Then, it is necessary to develop and evaluate fast and simple methods to determine synergism in vitro in microbiology laboratories. Objective: To develop a method to determine the synergism of ATM and CZA by MALDI-TOF MS (SynMALDI). Method: Klebsiella pneumoniae (n = 22) isolates with blaNDM and/or blaKPC genes were tested. The time–kill curve assay was performed for four isolates (three positives for blaNDM and blaKPC and one positive for blaNDM only). For SynMALDI, each isolate was incubated for 3 h in 4 tubes containing brain–heart infusion broth with the following: (1) no antibiotic; (2) ATM at 64 mg/L; (3) CZA at 10/4 mg/L; and (4) ATM at 64 mg/L plus CZA at 10/4 mg/L. After incubation, the bacterial protein extract was analyzed by MALDI-TOF MS, and the relative growth (RG) was determined for each isolate, considering intensities of the peaks of the bacterium incubated with antibiotic (tubes 2, 3, and 4) to the same bacterium incubated without antibiotic (tube 1), as follows: RG = IntensityWith antibiotic/IntensityWithout antibiotic. The combination was determined as synergistic when there was an RG decrease of 0.3 in the antibiotic combination in relation to the RG of the most active antibiotic alone. Results: The combination of ATM plus CZA proved to be synergic by time–kill curve assay. All isolates tested with the SynMALDI method also presented synergism. Conclusions: Detection of synergism for ATM plus CZA combination can be determined by MALDI-TOF MS, providing fast results in order to improve patient treatment

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO DE DELAFLOXACINO FRENTE A STAPHYLOCOCCUS AUREUS DE PACIENTES INTERNADOS EM HOSPITAL TERCIÁRIO NO SUL DO BRASIL

Introdução: Recentemente aprovado para uso no Brasil, o Delafloxacino - antimicrobiano da classe das quinolonas – é uma importante alternativa no combate à infecções por Staphylococcus aureus, inclusive aos resistentes à meticilina (MRSA). O Delafloxacino é indicado para infecções de pele e partes moles e também para pneumonia comunitária, porém ainda não há muitos estudos sobre a atividade in vitro deste antimicrobiano no Brasil. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade in vitro de delafloxacino frente a isolados de Staphylococcus aureus obtidos de pacientes internados em hospital terciário no Sul do Brasil. Materiais e métodos: Foram selecionados aleatoriamente 44 isolados de Staphylococcus aureus (10 de infecções em partes moles, 28 de vias respiratórias e 6 de hemoculturas), que haviam sido testados por disco difusão para os antimicrobianos levofloxacino e oxacilina (discos de cefoxitina) conforme rotina do laboratório de microbiologia. Foi determinada a concentração inibitória mínima (MIC) pelo teste de fita de gradiente de concentração com delafloxacino na faixa de 0,002-32 mg/L. A interpretação foi realizada de acordo com o BrCAST. Resultados: S.aureus obtidos de partes moles apresentaram sensibilidade ao delafloxacino (MIC ≤ 0,25 mg/L). Destes, 20% (2/10) eram resistentes à oxacilina e ao levofloxacino. S.aureus das vias respiratórias apresentaram 60,7% (17/28) de sensibilidade ao delafloxacino e 100% apresentaram sensibilidade à oxacilina e sensibilidade aumentando exposição ao levofloxacino. Em relação as amostras de hemoculturas, a maior MIC foi de 0,004 mg/L. Embora não existam pontos de corte clínicos nem pontos de corte pK/pD para este tipo de amostra clínica, há ponto de corte epidemiológico (ECOFF), que indicaria a ausência de mecanismos de resistência quando a MIC é ≤ 0,016 mg/L. Conclusão: Em comparação com levofloxacino, o delafloxacino demonstrou ter boa atividade in vitro em infecções de partes moles por Staphylococcus aureus. Já para isolados de amostras respiratórias, não foi possível observar o mesmo. Embora poucos isolados MRSA tenham sido detectados, o delafloxacino poderia ser uma boa alternativa no tratamento de infecções por Staphylococcus aureus isolados principalmente de partes moles

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO DE CEFIDEROCOL, CEFTAZIDIMA/AVIBACTAM E MEROPENEM/VABORBACTAM CONTRA BACTÉRIAS MULTIRRESISTENTES OBTIDAS DE PACIENTES INTERNADOS EM HOSPITAL TERCIÁRIO NO SUL DO BRASIL

Introdução: Novos antimicrobianos como ceftazidima-avibactam (CAZ/AVI), meropenem-varborbactam (MERO/VAR) e cefiderocol foram introduzidos na clínica médica nos últimos anos a fim de combater infecções causadas por contra bacilos gram-negativos (BGN) resistentes aos carbapenêmicos (RC). Destes, apenas CAZ/AVI até o momento foi aprovado pela ANVISA para uso no Brasil. Assim, é necessário avaliar a atividade antibacteriana in vitro aos novos antimicrobianos. Este estudo teve como objetivo avaliar a atividade in vitro de CAZ/AVI, MERO/VAR e cefiderocol contra BGN-RC, bem como caracterizar estes BGN quanto à produção de carbapenemases. Métodos: 123 isolados de BGN-RC foram selecionados no período de janeiro a abril de 2023 (92 Enterobacterales, 13 Acinetobacter baumannii/calcoaceticus complexo e 18 Pseudomonas spp.). Para análise de CAZ/AVI e cefiderocol foram utilizados discos de antibióticos com 14 µg e 30 µg, respectivamente. Para análise de MERO/VAR foram utilizadas fitas de gradiente de concentração na faixa de 0.016/8-256/8 mg/L. A interpretação foi realizada de acordo com o BrCAST. Para a análise de carbapenemases foi realizado PCR em tempo real para os seguintes genes: blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like, blaGES, blaSPM-1, blaIMP e blaVIM. O gene blaOXA-23 foi pesquisado por PCR convencional e apenas em Acinetobacter sp. Resultados: No total, 15 isolados apresentaram resistência a cefiderocol (12%), 51 (41%) à MERO/VAR e 62 (50%) à CAZ/AVI. Entre os BGN resistentes ao cefiderocol, 8 foram positivos para blaNDM, 2 co-produtores de blaKPC e blaNDM, 2 blaKPC, 2 blaOXA-23 e 2 negativos para os genes pesquisados. Entre os isolados resistentes à MERO/VAR, 25 foram positivos para blaNDM, 13 para blaKPC, 1 para blaOXA-48-like, 3 co-produtores de blaKPC e blaNDM, 1 blaVIM, 1 blaIMP e 7 apresentaram resultados negativos na pesquisa de carbapenemases. Dos 62 BGNs resistentes à CAZ/AVI, 55 eram produtores de metalo-beta-lactamases - MBL (48 blaNDM, 5 blaKPC e blaNDM, 1 blaIMP e 1 blaVIM) e 1 era positivo para blaOXA-48-like; 6 foram negativos na pesquisa de carbapenemases. Conclusão: Com o aumento de MBL nos últimos anos, a terapia com CAZ/AVI - considerada como opção terapêutica contra BGN-RC - pode não ser efetiva pois CAZ/AVI não é ativo contra bactérias produtoras de MBL. A avaliação da suscetibilidade de BGN aos novos antimicrobianos é importante para gerar dados epidemiológicos locais antes da introdução destes antibióticos na prática clínica