Funções celulares da proteína centrossomal humana TBCCD1: proteínas interatuantes e papel na dinâmica dos microtúbulos

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A proteína humana centrossomal TBCCD1 está envolvida na ligação do centrossoma ao núcleo. A diminuição dos níveis do TBCCD1 causa a quebra do eixo de polaridade intrínseca “Núcleo-Centrossoma-Complexo de Golgi” em consequência da anormal localização do centrossoma na periferia da célula a qual é acompanhada por uma desorganização do complexo de Golgi. Recentemente, foram identificadas variantes de splicing alternativo desta proteína que se localizam exclusivamente no citoplasma. Neste trabalho pretendeu-se esclarecer as funções da proteína TBCCD1 e da TBCCD1 variante 2, através i) do estudo do efeito da depleção da TBCCD1 na dinâmica dos microtúbulos e no citoesqueleto de actina e ii) da identificação das suas proteínas interatuantes, recorrendo ao método de BioID. Apesar de a TBCCD1 ter um domínio que a associa com a actina e interagir com várias proteínas que têm como funções polimerizar os filamentos de actina, em particular nas junções célula-célula e de adesão, não foi possível identificar nenhuma relação clara entre a TBCCD1 e os filamentos de actina nas células depletadas de TBCCD1. Este trabalho permitiu concluir que a TBCCD1 tem um papel importante na estabilização dos microtúbulos em células hTERT-RPE-1, em particular de uma subpopulação de microtúbulos que rodeia o núcleo e que se localiza preferencialmente do lado do centrossoma. Esta subpopulação de microtúbulos regula parcialmente o posicionamento do centrossoma em relação ao núcleo nestas células. Observou-se ainda que a depleção da TBCCD1 causa a dispersão da proteína centrossomal CEP170, que se associa a esta subpopulação de microtúbulos, e fica dispersa no citoplasma das células depletadas de TBCCD1. Neste trabalho foi também possível estabelecer o interatoma da TBCCD1 e da TBCCD1 variante 2. Assim, observou-se que a TBCCD1 interatua com proteínas com distintas funções celulares, estando principalmente envolvida na dinâmica dos microtúbulos, com a integridade do centrossoma e na polaridade celular, particularmente no estabelecimento e manutenção das junções celulares. A análise do interatoma, conjuntamente com os resultados obtidos no estudo da dinâmica dos microtúbulos, sugere que a TBCCD1 seja uma proteína adaptadora que promove a interação entre diferentes proteínas. A TBCCD1 variante 2, por outro lado, interage sobretudo com chaperones moleculares, proteínas mitocondriais e centroméricas. Embora à primeira vista estas interações possam parecer não estar relacionadas, uma análise mais detalhada mostra que a TBCCD1 variante 2 poderá estar envolvida na montagem e organização de estruturas complexas como os cinetocoros e a organização do genoma mitocondrial através da interação direta com os diferentes componentes ou através da interação com chaperones moleculares.The human centrosomal protein TBCCD is involved in the connection between the centrosome and the nucleus. Lower TBCCD1 levels lead to a disrupture of the intrinsic cell polarity axis “Nucleus-Centrosome-Golgi Apparatus” due to an abnormal localization of the centrosome in the cell periphery, which is accompanied by the fragmentation of the Golgi apparatus. Recently, TBCCD1 splicing variants that localize exclusively in the cytoplasm have been identified. In this work we aimed at clarifying what are the cellular functions of TBCCD1 and TBCCD1 variant 2 by i) studying the effect of TBCCD1 depletion in the microtubule network and actin cytoskeletons dynamics and ii) identifying their interacting proteins using the BioID method. Although TBCCD1 has a domain able to associate this protein with actin and TBCCD1 interacts with several proteins that have a role in actin polymerization, particularly in cell-cell and adhesion junctions, it was not possible to identify a clear relationship between TBCCD1 and the actin filaments in TBCCD1-depleted cells. This work allowed us to conclude that TBCCD1 has an important role in microtubule stabilization in hTERT-RPE-1 cells, in particularly in a microtubule subpopulation surrounding the nucleus which is localized preferentially near the centrosome. This microtubule subpopulation partially regulates the centrosome-nucleus positioning. We also observed that TBCCD1 depletion causes cytoplasmic dispersion of the centrosomal protein CEP170, which is associated with this microtubule subpopulation. In this work we also established the TBCCD1 and TBCCD1 variant 2 interactomes. TBCCD1 interacts with several proteins with distinct functions, mainly involved in microtubule dynamics, centrosome integrity and cell polarity, and also in the establishment and maintenance of cell junctions. Both the interactome analysis and the results obtained with the microtubule dynamic studies suggest that TBCCD1 may function as a promoter of the interaction between distinct proteins. TBCCD1 variant 2, in other hand, interacts mainly with molecular chaperones and mitochondrial and centromeric proteins. Although it may seem that these interactions are not related with which other, a more detailed analysis shows that TBCCD1 variant 2 protein can be involved in the assembly and organization of complex structures, such as the kinetochores and the organization of the mitochondrial genome either through the direct interaction with the different components or through the interaction with molecular chaperones