In Vitro Mutagenic and Genotoxic Assessment of a Mixture of the Cyanotoxins Microcystin-LR and Cylindrospermopsin

The co-occurrence of various cyanobacterial toxins can potentially induce toxic effects different than those observed for single cyanotoxins, as interaction phenomena cannot be discarded. Moreover, mixtures are a more probable exposure scenario. However, toxicological information on the topic is still scarce. Taking into account the important role of mutagenicity and genotoxicity in the risk evaluation framework, the objective of this study was to assess the mutagenic and genotoxic potential of mixtures of two of the most relevant cyanotoxins, Microcystin-LR (MC-LR) and Cylindrospermopsin (CYN), using the battery of in vitro tests recommended by the European Food Safety Authority (EFSA) for food contaminants. Mixtures of 1:10 CYN/MC-LR (CYN concentration in the range 0.04-2.5 µg/mL) were used to perform the bacterial reverse-mutation assay (Ames test) in Salmonella typhimurium, the mammalian cell micronucleus (MN) test and the mouse lymphoma thymidine-kinase assay (MLA) on L5178YTk± cells, while Caco-2 cells were used for the standard and enzyme-modified comet assays. The exposure periods ranged between 4 and 72 h depending on the assay. The genotoxicity of the mixture was observed only in the MN test with S9 metabolic fraction, similar to the results previously reported for CYN individually. These results indicate that cyanobacterial mixtures require a specific (geno)toxicity evaluation as their effects cannot be extrapolated from those of the individual cyanotoxins.España Ministerio de Economía y Competitividad AGL2015-64558-

Freshwater algal toxins: Monitoring and toxicity profile

Ministerio de Ciencia e Innovación PID2019-104890RB-I00, MICINN/FEDER, U

Evaluación de la liberación in vivo de iones metálicos a partir de aparatología ortodóncica en diversas matrices y sus potenciales efectos tóxicos

La biocompatibilidad de la aparatología ortodóncica es una fuente de investigación en los últimos años ya que está íntimamente relacionada con la liberación de iones metálicos al organismo humano e inducción potencial de efectos biológicos. Dentro del medio intraoral, durante un tratamiento de ortodoncia, que habitualmente comprende 2-3 años, las células orales están en contacto directo con la aparatología ortodóncica. Así mismo, la cavidad oral es un medio ideal para los procesos de corrosión, dadas sus características de humedad, pH y microbiológicas. La aparatología ortodóncica está compuesta por bandas, brackets, arcos y muelles, entre otros dispositivos. A lo largo de los años, los materiales ortodóncicos han evolucionado siguiendo las necesidades de los tratamientos, apareciendo materiales como la aleación níquel-titanio en los años 70, que se caracteriza por un 55% de níquel y 43% de titanio, utilizándose en las primeras fases de tratamiento para el alineamiento y nivelación. Así mismo, aparecieron materiales como el acero, ßTi y TMA (titanio-molibdeno-aluminio). Con el fin de englobar la literatura ortodóncica en relación a la liberación de metales en la cavidad oral, se realizó una revisión de los estudios más recientes examinando tanto la propia liberación de iones metálicos, como los efectos tóxicos de dichos iones con especial interés en su citotoxicidad y genotoxicidad. Estudios previos sugieren que se debe realizar un análisis de cada caso para tener conciencia del aumento de la variabilidad de los materiales, su composición y los procesos de manufacturación. Los estudios acerca de la toxicidad in vivo son escasos, por lo que se deberían realizar nuevas investigaciones para intentar clarificar los resultados contradictorios existentes hasta la actualidad, así como para investigar los mecanismos tóxicos implicados en los efectos observados, con especial énfasis en el daño oxidativo. Por otra parte, son necesarios nuevos estudios de monitorización in vitro e in vivo que permitan establecer relaciones de causa-efecto entre la liberación de iones metálicos y biomarcadores de citotoxicidad y genotoxicidad. Los resultados de esta revisión dieron lugar a la siguiente publicación: IN VITRO AND IN VIVO EVIDENCE OF THE CYTOTOXIC AND GENOTOXIC EFFECTS OF METAL IONS RELEASED BY ORTHODONTIC APPLIANCES: A REVIEW (Martín-Cameán A y col., 2015. Enviado a Environmental Toxicology and Pharmacology, aceptado Mayo 2015). Ademas, se ha llevado a cabo una revisión sistemática siguiendo las directrices PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Empleando tanto fuentes electrónicas [CENTRAL,MedLine;SCOPUS; EMBASE, Cochrane Library, ISI Web of Science, PASCAL, OVID HealthSTAR, y EBM] y búsquedas manuales [OpenGrey; Google Scholar] se analizaron los efectos cito/genotóxicos de este tipo de aplicaciones ortodoncias en humanos. Se seleccionaron 17 artículos y 6 estudios finalmente cumplieron los criterios (PICOS). Se observaron diferencias significativas en la mayoría de los estudios (5 de 6) respecto a daños citotóxicos y genotóxicos después de un tratamiento corto (1-3 meses) y a mas largo plazo (24-48 meses). Algunos estudios que evaluaron efectos post-tratamiento (2 de 3) no encontraron diferencias significativas con respecto a los controles después de eliminar las aplicaciones ortodóncicas. Se concluye por tanto, la necesidad de llevar a cabo rigurosos ensayos clinicos aleatorios para determinar la continuidad de los daños cito/genotóxicos inducidos durante el tratamiento ortodóncico en población joven (12-26 años). Los resultados de esta revisión dieron lugar a la siguiente publicación: GENOTOXIC, CYTOTOXIC EFFECTS AND GENE EXPRESSION CHANGES INDUCED BY ORTHODONTIC FIXED APPLIANCES OVER ORAL MUCOSA CELLS: A SYSTEMATIC REVIEW. Martín-Cameán A et al., 2015. Submitted to Oral Diseases (under revision) Diversos estudios han evaluado la liberación de iones metálicos a partir de aparatología ortodóncica en fluidos biológicos. La liberación de los elementos se ha medido principalmente mediante espectrometría de absorción atómica (AAS), espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) o a través de espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). La mayoría de ellos han concluido que no se alcanzan concentraciones tóxicas en saliva y suero. Sin embargo, concentraciones no tóxicas pueden ser suficientes para producir cambios biológicos en la mucosa oral. Debido a que la liberación de metales en células de mucosa oral, que han estado en contacto prolongado con la aparatología fija, en pacientes de ortodoncia se ha estudiado mínimamente y no existen datos de validación previa disponibles, consideramos de importancia desarrollar y optimizar un procedimiento analítico para determinar titanio (Ti), vanadio (V), zirconio (Zr), cobalto (Co), cromo (Cr), cobre (Cu) y níquel (Ni) en células de mucosa oral en pacientes con y sin tratamiento de ortodoncia mediante ICP-MS. El procedimiento analítico se basa en la extracción y digestión de las muestras en medio ácido y cuantificación simultánea de los elementos. El método fue validado adecuadamente: la ecuación de regresión fue calculada a partir de los estándares preparados en la misma matriz sin células de mucosa oral y el rango lineal fue de 0.5-50.0 ng/mL para el Zr, de 5.0-50.0 ng/mL para Ti y V, y de 2.0-100.0 ng/mL para Co, Cr, Cu y Ni. Los límites de detección fueron de 0.9, 2.8 y 0.4 ng/mL para Ti, V y Zr, respectivamente; mientras que fueron de 0.10, 0.38, 0.49 y 0.67 ng/mL para Co, Cr, Cu y Ni, respectivamente. Los límites de cuantificación fueron de 1.8, 3.4 y 0.7 ng/mL para Ti, V y Zr, respectivamente, mientras que fueron de 0.20, 1.13, 0.98 y 1.81 ng/mL para Co, Cr, Cu y Ni, respectivamente. Los porcentajes de recuperación (%) obtenidos oscilaron entre 101-108 para el Ti, 98-111 para el V, 92-104 para el Zr, 104-109 para el Co, 103-107 para el Cr, 106-113 para el Cu y 84-110 para el Ni. Los datos de precisión intermedia (RSD%) fueron adecuados para todos los elementos, a los tres niveles de concentración elegidos. El método resultó robusto para los tres factores que se consideraron en el proceso de tratamiento de la muestra: tiempo de calentamiento, volumen de agua desionizada, y volumen de HNO3 PlasmaPure 65% utilizado para diluir las muestras, lo cual permite su validación y aplicación a células de mucosa oral en pacientes ortodóncicos. Los métodos validados se aplicaron con éxito a la determinación de la liberación de dichos iones metálicos en 40 pacientes, 20 de los cuales se encontraban bajo tratamiento de ortodoncia (13-15 meses) y 20 individuos control. Se evaluaron los resultados obtenidos, encontrándose contenidos significativamente superiores de Co, Cr , Cu y Ni en el grupo tratado en comparación con el grupo control, siendo las concentraciones detectadas inferiores a las Ingestas diarias tolerables (IDT) (Ni, Co) o a sus niveles máximos de ingesta tolerable establecidos (UL) de los elementos estudiados (Cr, Cu). Los resultados de estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: VALIDATION OF A METHOD TO QUANTIFY TITANIUM, VANADIUM AND ZIRCONIUM IN ORAL MUCOSA CELLS BY INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) (Martín Cameán A y col., 2014. Talanta 118:238-244) DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN INDUCTIVELY COUPLED PLASMA MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) METHOD FOR THE DETERMINATION OF COBALT, CHROMIUM, COPPER AND NICKEL IN ORAL MUCOSA CELLS (Martín-Cameán A y col., 2014. Microchemical Journal 114:73-79) La cavidad oral es un medio particularmente ideal para la biodegradación de metales debido a sus propiedades iónicas, térmicas, microbiológicas y enzimáticas. En este contexto, las aleaciones ortodóncicas emiten corrientes electrogalvánicas tomando como medio la saliva, produciendo una liberación de iones metálicos a la mucosa oral. Diversos factores afectan a la liberación de iones, tales como el proceso de manufacturación, tipo de aleación, características de la superficie del material y envejecimiento de la aleación. Los metales no son biodegradables, y su liberación constante puede producir efectos tóxicos irreversibles debido a su acumulación en los tejidos. El pelo de cuero cabelludo humano es un vehículo de excreción de sustancias diversas (metales pesados, drogas de adicción etc.,), llegando a estar considerada esta matriz no invasiva como uno de los materiales biológicos más importantes de monitorización ambiental. A pesar de las numerosas ventajas que presenta el pelo en biomonitorización humana, los procedimientos analíticos para la determinación de liberación de metales en ortodoncia en dicha matriz son escasos, existiendo únicamente un estudio preliminar (procedimiento no validado, muy escaso número de pacientes) que demostró la no existencia de diferencias significativas en el contenido de algunos elementos metálicos en pelo de pacientes bajo tratamiento. Nuestro estudio se centró en la evaluación de niveles de Cu, Cr, Fe, Mn y Ni en pelo humano de una amplia población tratada con aparatología ortodóncica (n=70) para determinar, si la concentración de un metal dado estaba influenciado por el tratamiento ortodóncico en comparación a un grupo control (n=56). Los niveles de los compuestos metálicos se determinaron a través de espectrometría de absorción atómica (AAS), con diferentes modalidades, llama (Cu, Fe) y cámara de grafito (GF-AAS) (Cr, Mn, Ni). Se estudió la influencia de factores individuales (género, edad) en las concentraciones de metales, se estudiaron interacciones interelementales mediante la evaluación de coeficientes de correlación entre elementos, así como mediante un análisis de regresión múltiple. Las diferencias en el contenido metálico en pelo fue significativamente mayor sólo en el caso de Mn cuando se comparó con el grupo control, aunque los contenidos pueden considerarse de la misma magnitud que otras poblaciones control y, consecuentemente, no se asocian a riesgos debidos al tratamiento. El tratamiento de ortodoncia incrementó significativamente los niveles de Mn en pacientes jóvenes (<20 años) cuando se compararon con el grupo control. El análisis del pelo humano es un buen método para investigar la liberación de elementos a partir de la aparatología ortodóncica. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: BIOMONITORIZATION OF CHROMIUM, COPPER, IRON, MANGANESE AND NICKEL IN SCALP HAIR FROM ORTHODONTIC PATIENTS BY ATOMIC ABSORPTION SPECTROMETRY (Martín-Cameán A y col., 2014. Environmental Toxicology and Pharmacology 37:759-771) Los microtornillos se utilizan, a día de hoy, habitualmente en los tratamientos de ortodoncia gracias a sus buenos resultados en la práctica clínica. Estos aditamentos se han popularizado ampliamente debido a su simplicidad en el manejo, bajo coste y la mínima necesidad de colaboración por parte del paciente. A pesar del elevado uso de los microtornillos en ortodoncia recientemente, los datos en la literatura ortodóncica en relación a su biocompatibilidad son muy escasos. Algunos metales propios de su composición como Ni y Cr pueden causar hipersensibilidad, dermatitis, asma y citotoxicidad. Así mismo, tienen un potencial genotóxico y carcinogénico significativo, efectos no relacionados con la dosis de exposición. La evaluación de los agentes genotóxicos se puede llevar a cabo mediante el análisis del daño de ADN primario, como se realiza en el ensayo cometa o ¿alkaline single cell gel electrophoresis¿. Este ensayo es el método de elección para la medición de daño de ADN en células humanas en poblaciones expuestas a agentes genotóxicos. Hasta ahora, no existían estudios acerca del potencial genotóxico de los microtornillos en células de mucosa oral en humanos. Teniendo en cuenta la ausencia de estudios en este campo, el objetivo de nuestro estudio fue investigar el daño de ADN en células bucales de pacientes en tratamiento de ortodoncia mediante el ensayo del cometa en comparación con pacientes en tratamiento ortodóncico con microtornillos, y con respecto a un grupo control no tratado y un grupo de personas fumadoras (grupo control positivo). En el grupo de pacientes con tratamiento ortodóncico y en el de ortodoncia+microtornillos se obtuvo un incremento significativo (2 veces más) de %ADN en la cola del cometa en comparación con el grupo control. Las mujeres mostraron un aumento significativo del %ADN en todos los tratamientos en comparación con el grupo control, mientras que los hombres mostraron daño de forma significativa únicamente en el grupo de ortodoncia y microtornillo. En conclusión, la aparatología ortodóncica convencional induce genotoxicidad, y la incorporación de los microtornillos estudiados no implica un aumento adicional de daño del ADN. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: EVALUATION OF GENOTOXICITY OF ORTHODONTIC MINISCREWS ON MUCOSA ORAL CELLS BY THE ALKALINE COMET ASSAY (Martín-Cameán A y col., 2014. Toxicology Mechanisms and Methods, aceptado abril 2015) Tras confirmar el efecto genotóxico de la aparatología ortodóncica y la inocuidad de los microtornillos en cuanto al daño celular adicional, quisimos cuantificar las diferencias en la liberación de metales como el aluminio (Al), cobre (Cu), cromo (Cr), manganeso (Mn), níquel (Ni), titanio (Ti) y vanadio (V) en células orales de pacientes bajo tratamiento ortodóncico convencional (brackets, bandas y arcos) en comparación con pacientes tratados adicionalmente con microtornillos, y con, respecto a un grupo control, utilizando ICP-MS. Las resultados obtenidos revelaron el siguiente orden ascendente: Cr < Ni < Ti < Cu < Al, y el Co y V fueron prácticamente no detectados. Se encontraron diferencias significativas en comparación con el grupo control para el Cu en el grupo ortodóncico, y para el Ni en ambos grupos, tanto grupo ortodóncico como grupo ortodoncia+microtornillo. Se realizaron correlaciones potenciales entre los elementos metálicos, encontrándose una correlación positiva Al/Ti, y en relación a varios factores clínicos. Se concluye que los microtornillos no incrementan de forma significativa la liberación de metales. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: IN VIVO DETERMINATION OF ALUMINIUM, COBALT, CHROMIUM, COPPER, NICKEL, TITANIUM AND VANADIUM IN ORAL MUCOSA CELLS FROM ORTHODONTIC PATIENTS WITH MINI-IMPLANTS BY INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) (Martín-Cameán A y col., 2015. Enviado a Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, aceptado mayo 2015) Para finalizar, teniendo en cuenta los resultados derivados de los experimentos realizados en la presente Tesis Doctoral, queda demostrada la liberación de iones metálicos a partir de aparatología ortodóncica, incluyendo microtornillos, a partir de pelo y células de mucosa oral, y su componente genotóxico, contribuyendo de esta forma a ampliar el conocimiento que actualmente podemos encontrar en la bibliografía científica en relación a estos materiales.Premio Extraordinario de Doctorado U

Analysis of the Use of Cylindrospermopsin and/or Microcystin-Contaminated Water in the Growth, Mineral Content, and Contamination of Spinacia oleracea and Lactuca sativa

Cyanobacteria and cyanotoxins constitute a serious environmental and human health problem. Moreover, concerns are raised with the use of contaminated water in agriculture and vegetable production as this can lead to food contamination and human exposure to toxins as well as impairment in crop development and productivity. The objective of this work was to assess the susceptibility of two green vegetables, spinach and lettuce, to the cyanotoxins microcystin (MC) and cylindrospermopsin (CYN), individually and in mixture. The study consisted of growing both vegetables in hydroponics, under controlled conditions, for 21 days in nutrient medium doped with MC or CYN at 10 μg/L and 50 μg/L, or CYN/MC mixture at 5 + 5 μg/L and 25 + 25 μg/L. Extracts from M. aeruginosa and C. ovalisporum were used as sources of toxins. The study revealed growth inhibition of the aerial part (Leaves) in both species when treated with 50µg/L of MC, CYN and CYN/MC mixture. MC showed to be more harmful to plant growth than CYN. Moreover spinach leaves growth was inhibited by both 5 + 5 and 25 + 25 µg/L CYN/MC mixtures, whereas lettuce leaves growth was inhibited only by 25 + 25 µg/L CYN/MC mixture. Overall, growth data evidence increased sensitivity of spinach to cyanotoxins in comparison to lettuce. On the other hand, plants exposed to CYN/MC mixture showed differential accumulation of CYN and MC. In addition, CYN, but not MC, was translocated from the roots to the leaves. CYN and MC affected the levels of minerals particularly in plant roots. The elements most affected were Ca, K and Mg. However, in leaves K was the mineral that was affected by exposure to cyanotoxinsEspaña, MINECO/FEDER Project AGL2015-64558-

In vitro toxicological assessment of cylindrospermopsin: A review

Cylindrospermopsin (CYN) is a cyanobacterial toxin that is gaining importance, owing to its increasing expansion worldwide and the increased frequency of its blooms. CYN mainly targets the liver, but also involves other organs. Various mechanisms have been associated with its toxicity, such as protein synthesis inhibition, oxidative stress, etc. However, its toxic effects are not yet fully elucidated and additional data for hazard characterization purposes are required. In this regard, in vitro methods can play an important role, owing to their advantages in comparison to in vivo trials. The aim of this work was to compile and evaluate the in vitro data dealing with CYN available in the scientific literature, focusing on its toxicokinetics and its main toxicity mechanisms. This analysis would be useful to identify research needs and data gaps in order to complete knowledge about the toxicity profile of CYN. For example, it has been shown that research on various aspects, such as new emerging toxicity effects, the toxicity of analogs, or the potential interaction of CYN with other cyanotoxins, among others, is still very scarce. New in vitro studies are therefore welcome.Ministerio de Economía y Competitividad AGL2015-64558-

Toxic Effects Produced by Anatoxin-a under Laboratory Conditions: A Review

The presence of cyanotoxins and its bioaccumulation in the food chain is an increasingly common problem worldwide. Despite the toxic effects produced by Anatoxin-a (ATX-a), this neurotoxin has been less studied compared to microcystins (MCs) and cylindrospermopsin (CYN). Studies conducted under laboratory conditions are of particular interest because these provide information which are directly related to the effects produced by the toxin. Currently, the World Health Organization (WHO) considers the ATX-a toxicological database inadequate to support the publication of a formal guideline reference value. Therefore, the aim of the present work is to compile all of the in vitro and in vivo toxicological studies performed so far and to identify potential data gaps. Results show that the number of reports is increasing in recent years. However, more in vitro studies are needed, mainly in standardized neuronal cell lines. Regarding in vivo studies, very few of them reflect conditions occurring in nature and further studies with longer periods of oral exposure would be of interest. Moreover, additional toxicological aspects of great interest such as mutagenicity, genotoxicity, immunotoxicity and alteration of hormonal balance need to be studied in depth.España Ministerio de Ciencia e Innovación PID2019-104890RBI00/AEI/10.13039/50110001103

Is single layer graphene a promising anode for sodium-ion batteries?

In an attempt to find an adequate carbon material to achieve a successful reversible adsorption of Na+ ions, single layer graphene, is experimentally investigated in this work, for the first time, as anode for sodium-ion batteries. To this end, single layer graphene that was grown on copper foil by chemical vapor deposition was subjected to extended galvanostatic cycling and to cyclic voltammetry in the potential range of 0-2.8 V versus Na/Na+. Regardless of the current density and electrolyte formulation used, the amount of Na+ ions adsorbed/desorbed reversibly per surface area (specific reversible cell capacity) was very modest and comparable to that obtained with bare copper electrodes of reference, thus suggesting that the reversible capacity of the single layer graphene electrode is mostly due to the electrochemical response of the copper substrate. These experimental results clearly agree with recent theoretical calculations showing that the adsorption of Na+ ions on the surface of single layer graphene is energetically unfavourable unless that surface includes significant defects density.Financial support from IBERDROLA FOUNDATION (www.fundacioniberdrola.org, Projects 2014-2015) and the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness MINECO (under Projects ENE2011-28318-CO-02 and ENE2014-52189-C2-2-R) is gratefully acknowledged. A. Ramos and N. Cuesta, respectively, thank the Spanish Research Council for Scientific Research (CSIC) for a JAE-Doc contract, co-funded by the European Social Fund (ESF), and the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) for a pre-doctoral grant (BES-2012-052711).Peer reviewe

New Method for Simultaneous Determination of Microcystins and Cylindrospermopsin in Vegetable Matrices by SPE-UPLC-MS/MS

Cyanotoxins are a large group of noxious metabolites with different chemical structure and mechanisms of action, with a worldwide distribution, producing effects in animals, humans, and crop plants. When cyanotoxin-contaminated waters are used for the irrigation of edible vegetables, humans can be in contact with these toxins through the food chain. In this work, a method for the simultaneous detection of Microcystin-LR (MC-LR), Microcystin-RR (MC-RR), Microcystin-YR (MC-YR), and Cylindrospermopsin (CYN) in lettuce has been optimized and validated, using a dual solid phase extraction (SPE) system for toxin extraction and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) for analysis. Results showed linear ranges (5–50 ng g−1 f.w.), low values for limit of detection (LOD) (0.06–0.42 ng g−1 f.w.), and limit of quantification (LOQ) (0.16–0.91 ng g−1 f.w.), acceptable recoveries (41–93%), and %RSDIP values for the four toxins. The method proved to be robust for the three variables tested. Finally, it was successfully applied to detect these cyanotoxins in edible vegetables exposed to cyanobacterial extracts under laboratory conditions, and it could be useful for monitoring these toxins in edible vegetables for better exposure estimation in terms of risk assessment.España MINECO AGL2015-64558-

Toxic cyanobacteria strains isolated from blooms in the Guadiana River (southwestern Spain)

This paper describes the occurrence of toxic cyanobacteria along the Guadiana River over its course between Mérida and Badajoz (Extremadura, Spain). Water sampling for phytoplankton quantification and toxin analysis was carried out regularly between 1999 and 2001 in six different locations, including two shallow, slow-flowing river sites, two streamed river sites and two drinking water reservoirs. The cyanobacterial community differed significantly between these locations, especially during the summer. The predominant genera were Microcystis, Oscillatoria, Aphanizomenon and Anabaena. Using an ELISA assay the total microcystin contents of natural water samples from the most eutrophic locations ranged from 0.10 – 21.86 µg mcyst-LR equivalent·L-1 in Valdelacalzada and 0.10-11.3 µg mcyst-LR equivalent·L-1 in Vitonogales, and a seasonal variation of toxin content was observed. The amount of microcystins produced by each strain was determined by ELISA assay and the detection and identification of microcystin variants of three toxic strains of Microcystis aeruginosa was performed by high performance liquid chromatography (HPLC). The analysis of microcystins of the cultured strains revealed that toxin production was variable among different strains of M. aeruginosa isolated either from different blooms or from the same bloom.Junta de Andalucía (CTS358