Análisis de la expresión diferencial de genes involucrados en las vías metabólicas responsables de la síntesis de antocianinas en frutos de Fragaria chilensis ssp. chiloensis f. chiloensis y Fragaria chiloensis ssp. chilensis f. patagónica

133 p.El objetivo de la tesis doctoral fue realizar un estudio comparativo de la pigmentación de fruto dentro de las dos formas botánicas de Fragaria chiloensis ssp. chiloensis. El estudio fue abordado a nivel transcripcional y químico. Para ello, frutos de ambas formas botánicas, f. chiloensis (frutilla nativa blanca) y f. patagonica (frutilla nativa roja), fueron recolectados en cuatro distintos estadios de desarrollo y maduración (verde pequeño, verde grande, blanco y maduro). A partir de fruto completo, sus órganos constituyentes (receptáculo y aquenio) y tejidos, se analizaron los perfiles transcripcionales de genes estructurales y regulatorios (factores de transcripción) involucrados en las vías de biosíntesis de compuestos fenilpropanoides responsables de la formación de antocianinas a lo largo de los diferentes estadios. Mediante este exhaustivo análisis transcripcional, se seleccionó uno de los genes regulatorios, FcMYB1, debido a su expresión diferencial detectada entre receptáculo de fruto rojo y blanco. El ortólogo de este gen aislado en frutilla comercial demostró ser un supresor de la acumulación de pigmentos antociánicos en el sistema heterólogo de Nicotiana. Para caracterizar su función de manera homóloga en Fragaria chiloensis ssp. chiloensis f. chiloensis, frutos de frutilla blanca en estadio verde grande fueron agroinyectados con una cepa de A. tumefaciens portadora de una construcción de RNAi para FcMYB1 y cosechados en estadio maduro. Este trabajo demostró que la supresión génica del factor de transcripción FcMYB1 propició la aparición de un fenotipo de frutos más pigmentados que los frutos control agroinyectados con vector vacío. Consecuentemente, los genes flavonoides finales relacionados con la biosíntesis de proantocianidinas mostraron niveles muy bajos de transcritos de leucoantocianidina reductasa (LAR) y antocianidina reductasa (ANR) en contraste con los niveles aumentados de transcritos de genes directamente relacionados con la biosíntesis de pigmentos antociánicos, antocianidina sintasa (ANS) y UDP-glicosiltransfersa (UFGT). Esta redirección a nivel transcripcional de la vía flavonoides coincidió con una mayor acumulación de antocianinas en frutos agroinyectados con la construcción RNAi-FcMYB1 detectadas por HPLC-DAD. En conclusión, por medio del estudio comparativo en frutos contrastantes en pigmentación de una misma especie de frutilla, se detectaron diferencias en los niveles de transcritos de genes estructurales y regulatorios. Tras este análisis se seleccionó un factor de transcripción que demostró ser importante en la producción de pigmentos en esta especie. Los genes diferencialmente expresados (estructurales y/o regulatorios) identificados en esta investigación pueden ser empleados como marcadores moleculares para asistir los programas de mejoramiento genético de frutilla./ABSTRACT: The aim of this doctoral thesis was to perform a comparative study of the fruit pigmentation of two botanical forms of Fragaria chiloensis ssp. chiloensis. The study was carried out at the transcriptional and chemical level. For this purpose, fruits of both botanical forms, f. chiloensis (white native strawberry) and f. patagonica (red native strawberry), were collected and sorted in four distinct developmental and ripening stages (small green, large green, white and ripe). From whole fruit, their constituent organs (receptacle and achene) and tissues, the transcriptional profiles of structural and regulatory (transcription factors) genes involved in anthocyanin related biosynthesis pathways were assessed among the different stages. By means of this exhaustive transcriptional analysis, FcMYB1, a regulatoty gene was selected due to its differential expression detected between the receptacle of red and white fruits. Its orthologous gene isolated from the commercial strawberry demonstrated it to be a suppressor of the anthocyanin pigment as shown by accumulation in the heterologous system Nicotiana. For characterizing its function in a homologue manner in Fragaria chiloensis ssp. chiloensis f. chiloensis, fruits of white strawberry at large green stage were agroinjected with an A. tumefaciens strain bearing a RNAi construct for FcMYB1 and collected at ripe stage. According to this work, the gene suppression of this FT FcMYB1 favored a more pigmented phenotype in these fruits than in control fruits agroinjected with empty vector. Consequently, the final flavonoid genes related with proanthocyanidin biosynthesis showed very low levels of leucoanthocyanidin reductase (LAR) and anthocyanidin reductase (ANR) in contrast to the elevated transcript levels of genes closely related to anthocyanic pigment biosynthesis, anthocyanidin synthase (ANS) y UDP-glycosyltransferse (UFGT). This flavonoid pathway redirection at the transcriptional level coincided with a greater accumulation of anthocyanin in RNAi-FcMYB1 agroinjected fruits assessed by HPLC-DAD. In conclusion, through this comparative study carried out in fruits with contrasting pigmentation in the same strawberry species, differences in transcript levels of structural and regulatory genes were detected. After this analysis, a transcription factor that proved to be important in the pigment production in this specie was selected. Differentially expressed (structural and/or regulatory) genes identified in this research could be used as molecular markers for assisting strawberry breeding programs

Evaluación de caracteres agronómicos en un programa de mejoramiento genético de arándanos (Vaccinium corymbosum L.)

52 p.En el marco de un creciente aumento en el mercado mundial y nacional de arándanos durante los últimos años y de la necesidad de contar con variedades adaptadas a nuestras zonas productivas, se justifica el programa de mejoramiento genético de arándanos de arbusto alto (highbush) que la empresa Genberries Ltda. desarrolla en Chile y del cual este estudio forma parte. Con el objetivo de seleccionar material con mejores características de calidad de fruta en cosecha y postcosecha, se estudió la fenología y caracteres de calidad de fruta de 79 genotipos, los que se encuentran divididos en 6 subgrupos con distinto número de representantes en cada uno: Rosados, Estrés, Avanzadas, Cosecha Tardía, Buena Postcosecha y Promisorias, los que el programa había seleccionado y agrupado previamente. El estudio se realizó en la Estación Experimental Panguilemo, de propiedad de la Universidad de Talca, ubicada en km 245, Ruta 5 Sur, Talca, Región del Maule, Chile (35° 22’ 15,3’’ Sur; 71° 35’ 43,6’’ Oeste). Se estudió el momento de ocurrencia, en días calendario a partir del 1 de enero de 2013, de 15 etapas fenológicas de crecimiento reproductivo, adaptadas de la tabla de estados de crecimiento de arándanos (Blueberry Growth Stages; Michigan State University, 2012), y ello se comparó con tres variedades comerciales de arándano de arbusto alto (highbush): Duke, Brigitta y Elliott, consideradas variedades de cosecha temprana, media estación y tardía, respectivamente. Además se evaluaron cinco caracteres de calidad de fruta: peso por fruto, firmeza, diámetro, sólidos solubles y pérdida de peso en frutos, tanto a cosecha como después de 60 días de almacenaje a 1°C, más dos días a temperatura ambiente (20-25°C). Los resultados muestran que frutos de los subgrupos Buena Postcosecha y Rosados, tenían mayor tamaño de frutos que los demás subgrupos. Además hacia el final de los 60 días (1°C), más dos días a temperatura ambiente (20-25°C) los subgrupos Cosecha Tardía y Buena Postcosecha obtuvieron los más altos niveles de firmeza, con 109,7 y 103,52 g/mm, respectivamente. No se observó grandes diferencias en el contenido de sólidos solubles entre los subgrupos, pero para todos los subgrupos hubo un aumento en su contenido conforme pasaron los días en almacenaje. En general, la pérdida de peso tuvo una tendencia lineal y se aceleró durante los días que la fruta estuvo a temperatura ambiente. También se encontró que existe una alta correlación entre el contenido de sólidos solubles y el diámetro de los frutos, que en general fue -0,55, significativa al p<0,001.Palabras clave: Arándano, mejoramiento genético, fenología, postcosecha, firmeza, sólidos solubles, pérdida de peso./ABSTRACT:In the light of an increasing demand over recent years in the world and national markets for blueberries and the need for varieties adapted to our production conditions, Genberries Ltda. developed a highbush blueberry breeding program in Chile, the material from which forms the basis for this study. With a view to selecting material with better fruit quality characteristics at harvest and postharvest, the phenology and fruit quality traits of 79 genotypes were studied. These 79 were divided into 6 subgroups with different numbers of representatives in each, namely: Rosados, Estrés, Avanzadas, Cosecha Tardía, Buena Postcosecha y Promisorias, which the program had previously selected and grouped. The study was conducted at the Panguilemo Estación Experimental, owned by the Universidad de Talca, located at km 245, Ruta 5 Sur, Talca, Región del Maule, Chile (35° 22' 15.3'' South, 71° 35' 43.6'' West). The timings of 15 phenological stages of reproductive growth were recorded as calendar days from January 1, 2013. The stages were, adapted from the Table of Blueberry Growth Stages (Michigan State University, 2012), and the observations were compared with three commercial varieties of high bush blueberry: Duke, Brigitta and Elliott, considered as early mid-season and late harvest varieties, respectively. Furthermore, five fruit quality traits were evaluated: fruit weight, firmness, diameter, soluble solids and weight loss in fruits, both at harvest and after 60 days of storage at 1 °C followed by two days at room temperature (20-25 °C). The results showed that fruit of Buena Postcosecha and Rosados subgroups, had fruit size greater than the other subgroups. Also at the end of 60 days (1°C), plus two days at room temperature (20-25°C), the subgroups Cosecha Tardía and Buena Postcosecha had the highest levels of firmness, at 109.7 and 103,5 g/mm, respectively. No major differences in the content of soluble solids between subgroups were detected, but for all subgroups there was an increase in soluble solids after time in storage. Overall, weight loss showed a linear trend, which accelerated during the days the fruit was at room temperature. Also, overall, a highly significant (p<0.001) negative correlation between soluble solids and fruit diameter was found.Key words: Blueberry, breeding, phenology, postharvest, firmness, soluble solids, weight los

Prospección de virus en Fragaria chiloensis (L.) Duch. y producción de plantas libres de patógenos por cultivo in vitro

150 p.Fragaria chiloensis ssp chiloensis (L.) Duch, es una planta nativa de Chile. Se han descrito dos formas botánicas para esta especie; la forma chiloensis, de fruto blanco-rosado que se cultiva en zonas cordilleranas y costeras, y la forma patagónica, que crece silvestre y produce frutos rojos y pequeños. F. chiloensis, que corresponde a uno de los progenitores de la frutilla comercial (F. x ananassa), produce frutos con características únicas que la convierten en un recurso genético con potencial para convertirse en una nueva alternativa para el mercado frutícola. Sin embargo, diversos problemas afectan la productividad de los huertos de F. chiloensis, incluyendo las prácticas de cultivo artesanal y el ataque por patógenos. Dentro de las enfermedades que afectan a los cultivos de frutilla comercial, las de origen viral pueden causar grandes pérdidas económicas. A nivel mundial se han identificado más de 30 virus que afectan a las especies del género Fragaria, pero existe poca información relacionada con F. chiloensis. Considerando que la propagación de plantas en los huertos se efectúa a través de estolones y que el manejo de vectores virales es poco habitual en el cultivo de frutilla blanca, se realizó un estudio para determinar el estado virológico actual de los huertos y de poblaciones silvestres de F. chiloensis y así, la ocurrencia y distribución de los principales virus que afectan a esta especie. Los virus transmitidos por áfidos: Strawberry crinkle virus (SCV), Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV), Strawberry mottle virus (SMoV) y Strawberry vein banding virus (SVBV) fueron encontrados en plantas silvestres y cultivadas, pero el porcentaje de plantas infectadas por SMYEV fue menor en las poblaciones silvestres (forma patagónica). Por otra parte, a nivel de campo en plantas silvestres y cultivadas, no se observaron síntomas atribuibles a la infección viral. Además, se evaluó la susceptibilidad de F. chiloensis a la infección por SMYEV, mediante ensayos de inoculación viral por injerto, y se identificaron los genotipos BAUxPUR (forma chiloensis), Petrohue y Osorno (forma patagónica) como genotipos de baja susceptibilidad a la infección por SMYEV. Los resultados sugieren que la forma botánica patagónica presenta menor susceptibilidad a la infección por SMYEV y que F. chiloensis es tolerante a la infección por SMYEV. Sin embargo, en condiciones de cultivo in vitro, las plantas infectadas por SMYEV presentaron disminución del crecimiento y desarrollo foliar. Este trabajo informa por primera vez las secuencias nucleotídicas parciales de aislados virales chilenos de SCV y SVBV y propone un sistema optimizado de saneamiento por cultivo in vitro de meristemas para obtener plantas de F. chiloensis libres de virus y en óptimas condiciones sanitarias que puede ser de utilidad para asistir programas de mejoramiento genético y de conservación del germoplasma nativo. La información generada en esta tesis podrá ser empleada para el desarrollo de estrategias que permitan el control de las infecciones virales, la conservación y el cultivo sustentable de la frutilla blanca chilena. /ABSTRACT: Fragaria chiloensis ssp chiloensis (L.) Duch, is a wild strawberry distributed naturally in Chile. Two botanical forms have been described; the white-fruited chiloensis, which is cultivated in the coastal mountains, and the small-red fruited patagonica, which grows in the wild. F. chiloensis, the mother of the current commercial strawberry (F. x ananassa), produces fruits with unique quality characters and has the potential to become a new alternative fruit in the market. However, several problems affect fruit yields including poor husbandry practices and plant diseases. About the strawberry diseases, viruses are one of the most important pathogens. In the world, more than 30 viruses affecting Fragaria species have been described but scarce information is available for F. chiloensis. With this latter problem in mind and considering that accumulation of viruses in propagated plants can produce important yield losses, we performed a survey of the viruses affecting wild and cultivated populations of F. chiloensis using classical methods and molecular tools. In addition, we implemented a methodology of virus-free plant production by meristem culture and micropropagation. Finally, we performed a study of virus infection in F. chiloensis and less susceptible genotypes were identified. Our results show that all populations of F. chiloensis studied were affected by aphid borne viruses (SCV, SMYEV, SMoV and SVBV) but the wild populations of plants had less SMYEV incidence than the cultivated plants. We report the first time the partial nucleotide sequences of Chilean isolates of SCV and SVBV. On the other hand, controlled infection experiments showed that F. chiloensis is tolerant to aphid borne virus infection. Nevertheless, SMYEV infected plants cultivated in vitro had low growth and leaf development. This evidence suggests that virus infections could affect yields of the F. chiloensis orchards. Furthermore, wild populations of F. chiloensis f. patagonica were less susceptible to SMYEV infection. We hypothesize that different defense mechanism affect the virus infection among botanic forms of F. chiloensis. Three less susceptible genotype were identified (BAU x PUR, Petrohue and Osorno) which can be used in strawberry breeding programs. F. chiloensis responds to low concentrations of growth regulators and the proposed methodology for healthy plant production using in vitro culture is effective and low cost. It can be useful to assist breeding programs and conservation strategies. This information can be used to develop strategies to control virus diseases, conservation and the improvement of the Chilean white strawberry culture

Desarrollo de protocolo de esterilización, para la introducción in vitro de Selliera radicans Cav

55 p.Selliera radicans Cav. es una especie nativa de Chile y pertenece a la familia Goodeniaceae, también es originaria de Australia y Nueva Zelanda. Su uso en horticultura ornamental es principalmente como césped, se establece alrededor de piscinas o humedales, y se ha probado también en techos verdes y jardines verticales. El cultivo in vitro se ha utilizado en distintas especies permitiendo una propagación masiva y uno de los primeros procedimientos en este proceso es la esterilización de los explantes. Debido a que no existen antecedentes de las características o necesidades de Selliera radicans Cav. para el establecimiento in vitro se ha realizado este estudio con la finalidad de desarrollar un protocolo de esterilización, para la introducción in vitro de Selliera radicans Cav, utilizando como explante un órgano aislado (nudos de estolones) y cultivo de planta intacta (semillas). De acuerdo con los resultados, se observó que los explantes provenientes de nudos de estolones, como también de las semillas, presentaron una alta contaminación por hongos y bacterias. Para el caso de explantes de nudos, la sobrevivencia fue muy baja (4 - 12%), sin embargo, los explantes sobrevivientes presentaron un adecuado crecimiento de brotes y raíces. A pesar de los resultados obtenidos, no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos, por lo que no se pudo determinar un buen protocolo para la introducción de material de Selliera radicans in vitro, sin embargo, se avanzó en el estudio de la oxidación de los explantes, definiendo que el contacto de éstos con una solución de hipoclorito de sodio al 15% por tiempos mayores a 15 minutos aumentan el porcentaje de oxidación. Esta oxidación sólo ocurrió en los nudos y tendió a aumentar con mayor concentración de los esterilizantes y mayor tiempo de exposición (40-60% de oxidación). Palabras claves: Selliera, cultivo in vitro, esterilización./ABSTRACT: Selliera radicans Cav. is a species native to Chile and belongs to the family Goodeniaceae, it is also native to Australia and New Zealand. Its use in ornamental horticulture is mainly as a grass, being used around swimming pools or wetlands, and has been tested as a plant for green roofs and vertical gardens. The in vitro culture has been used in different species allowing a massive propagation and one of the first procedures in this process is the sterilization of the explants. Because there are no reports about the characteristics or requirements of Selliera radicans Cav. for the establishment in vitro, this study has been carried out with the purpose of developing a sterilization protocol for the in vitro establishment of Selliera radicans Cav, using as an explant an isolated organ (stolon knots) and intact plant culture (seeds). According to the results, it was observed that the explants coming from knots of stolons, as well as from the seeds, presented a high contamination by fungi and bacteria. In the case of node explants, survival was very low (4 - 12%), however, the surviving explants showed an adequate growth of shoots and roots. Despite these results, no significant differences were observed among treatments, so it was not possible to determine a good protocol for the introduction of Selliera radicans material in vitro, however, progress was made in the study of the oxidation of the explants, determining that the contact of the explants with the sodium hypochlorite solution at 15% at times longer than 15 minutes increased the percentage of oxidation of the explants. This oxidation only occurred in the nodes and tended to increase with a higher concentration of sterilizers and longer time exposure (40-60% oxidation)