Ultrastructural and Cytotoxic Effects of Metarhizium robertsii Infection on Rhipicephalus microplus Hemocytes

Metarhizium is an entomopathogenic fungus widely employed in the biological control of arthropods. Hemocytes present in the hemolymph of invertebrates are the cells involved in the immune response of arthropods. Despite this, knowledge about Rhipicephalus microplus hemocytes morphological aspects as well as their role in response to the fungal infection is scarce. The present study aimed to analyze the hemocytes of R. microplus females after Metarhizium robertsii infection, using light and electron microscopy approaches associated with the cytotoxicity evaluation. Five types of hemocytes (prohemocytes, spherulocytes, plasmatocytes, granulocytes, and oenocytoids) were described in the hemolymph of uninfected ticks, while only prohemocytes, granulocytes, and plasmatocytes were observed in fungus-infected tick females. Twenty-four hours after the fungal infection, only granulocytes and plasmatocytes were detected in the transmission electron microscopy analysis. Hemocytes from fungus-infected tick females showed several cytoplasmic vacuoles with different electron densities, and lipid droplets in close contact to low electron density vacuoles, as well as the formation of autophagosomes and subcellular material in different stages of degradation could also be observed. M. robertsii propagules were more toxic to tick hemocytes in the highest concentration tested (1.0 × 108 conidia mL−1). Interestingly, the lowest fungus concentration did not affect significantly the cell viability. Microanalysis showed that cells granules from fungus-infected and uninfected ticks had similar composition. This study addressed the first report of fungal cytotoxicity analyzing ultrastructural effects on hemocytes of R. microplus infected with entomopathogenic fungi. These results open new perspectives for the comprehension of ticks physiology and pathology, allowing the identification of new targets for the biological control

How Dopamine Influences Survival and Cellular Immune Response of Rhipicephalus microplus Inoculated with Metarhizium anisopliae

Dopamine (DA) is a biogenic monoamine reported to modulate insect hemocytes. Although the immune functions of DA are known in insects, there is a lack of knowledge of DA’s role in the immune system of ticks. The use of Metarhizium anisopliae has been considered for tick control, driving studies on the immune response of these arthropods challenged with fungi. The present study evaluated the effect of DA on the cellular immune response and survival of Rhipicephalus microplus inoculated with M. anisopliae blastospores. Exogenous DA increased both ticks’ survival 72 h after M. anisopliae inoculation and the number of circulating hemocytes compared to the control group, 24 h after the treatment. The phagocytic index of tick hemocytes challenged with M. anisopliae did not change upon injection of exogenous DA. Phenoloxidase activity in the hemolymph of ticks injected with DA and the fungus or exclusively with DA was higher than in untreated ticks or ticks inoculated with the fungus alone, 72 h after treatment. DA was detected in the hemocytes of fungus-treated and untreated ticks. Unveiling the cellular immune response in ticks challenged with entomopathogenic fungi is important to improve strategies for the biological control of these ectoparasites

Asssociação de Metarhizium anisopliae sensu lato e cipermetrina para controle de Rhipicephalus microplus

Rhipicephalus microplus é responsável por grandes perdas econômicas na pecuária brasileira. Com o intuito de controlar esse artrópode, o uso indiscriminado de produtos químicos é amplamente empregado, acarretando em prejuízos ao meio ambiente, aos animais e humanos, além de contribuir para o aparecimento de cepas de carrapatos resistentes. Assim, o emprego de produtos químicos associados a entomopatógenos surge como uma alternativa para aumentar a eficácia do controle de carrapato e reduzir os danos causados pelo uso inapropriado de produtos químicos. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi de avaliar a eficiência da associação de Metarhizium anisopliae e cipermetrina sobre estágios imaturos de R. microplus. O tratamento dos grupos foi realizado através da imersão de ovos e larvas em 1mL de suspensão aquosa do fungo, solução de cipermetrina, suspenção fúngica associada à cipermetrina e um grupo controle. Os parâmetros biológicos avaliados foram o percentual de eclosão e o percentual de mortalidade das larvas. Observou se que o fungo quando utilizado sozinho em menor concentração (106 conídios mL-1) ou a cipermetrina também em menor concentração (25 ppm) não foram capazes de alterar os parâmetros biológicos quando comparados ao grupo controle. No entanto, a associação do fungo a 106 conídios mL-1 com cipermetrina em menor concentração, foi capaz de reduzir o percentual de eclosão pela metade e causar o dobro de mortalidade quando comparado ao uso do fungo e cipermetrina isoladamente. Desta forma, conclui se que a associação de M. anisopliae com cipermetrina é eficaz no controle de estágios imaturos de R. microplus

Association between Metarhizium anisopliae sensu lato and cypermethrin to control Rhipicephalus microplus

ABSTRACT. de Paulo J.F., Ferreira J.R.T., Marciano A.F., de Freitas, M.C. Coutinho-Rodrigues C.J.B., Camargo M.G., Angelo I.daC. Bittencourt V.R.E.P., Gôlo P.S. [Association between Metarhizium anisopliae sensu lato and cypermethrin to control Rhipicephalus microplus.] Associação de Metarhizium anisopliae sensu lato e cipermetrina para o controle de Rhipicephalus microplus. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 38(supl. 3):66-74, 2016. Departamento de Parasitologia Animal, Anexo 1, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural Rio de Janeiro, BR 465 Km 47, Seropédica, RJ 23890-000, Brasil. E-mail: [email protected] Rhipicephalus microplus is responsible for large economic losses in Brazilian livestock. In order to control this arthropod, the indiscriminate use of chemical products may be widely used, leading to damages to the environment, animals and humans, besides contributing to the appearance of resistant tick populations. The use of chemicals associated with biological entomopathogens drives an alternative to increase the effectiveness of tick control and reduce de damage caused by the inappropriate use of chemicals. Accordingly, the aim of the present study was to evaluate the efficiency of Metarhizium anisopliae and cypermethrin association on immature stages of R. microplus ticks. The groups were exposed by immersing the egg mass and larvae in 1 ml of fungal aqueous suspension, cypermethrin solution, cypermethrin associated to the fungal suspension and Tween 80 0.1% (v/v) (control). The biological parameters evaluated were: larval hatching percentage and larval mortality percentage. It was observed that both the fungus in a low concentration (106 conidia mL-1) or cypermethrin in a low concentration (25 ppm) were not able to change the biological parameters in comparison to the control group. Despite this, when associated the fungus at 106 conidia mL-1 with cypermethrin in a low concentration, together they were able to reduce larval hatching percentage and increase mortality in comparison to the single use of fungus or cypermethrin. Accordingly, it is concluded that the association of M. anisopliae with cypermethrin is a promising alternative to control of immature stages of R. microplus

Estudo morfológico de isolados de Beauveria bassiana antes e após reisolamento em Rhipicephalus microplus

Beauveria bassiana é um fungo artropodopatogênico cosmopolita que possui o carrapato dos bovinos Rhipicephalus microplus como hospedeiro. Neste cenário, estudos morfológicos e de produtividade conidial em meio de cultura podem indicar isolados que possuam potencial para produção em larga escala. O presente trabalho avaliou a macromorfologia e micromorfologia, além da produção conidial de dez isolados de B. bassiana antes e após uma passagem (ciclo de desenvolvimento) sobre R. microplus. Macroscopicamente, variações de diâmetro, aparência, aspecto de colônia, exsudação e cor de reverso foram observadas após o reisolamento. Por outro lado, o processo não alterou parâmetros como desenvolvimento dos conidióforos, formato e tamanho de conídios. Em relação à produção conidial, seis isolados aumentaram significativamente o número de conídios contados por área. Como destaque, o isolado Bb 02, que possui o carrapato como hospedeiro original de isolamento, apresentou aumento da pulverulência e produção conidial após apenas uma única passagem. Assim, acredita-se que para avaliações futuras com cunho comercial, estudos que envolvam mais passagens em hospedeiros em potencial, bem como sua associação a análises de patogenicidade e atividade enzimática, podem expressar resultados mais relevantes para o controle biológico

EFICIÊNCIA in vitro DE UMA FORMULAÇÃO OLEOSA DE Metarhizium anisopliae SENSU LATO NO CONTROLE DE Rhipicephalus microplus

Rhipicephalus microplus é um ectoparasito responsável por grandes perdas econômicas na pecuária bovina. Na tentativa de diminuir o emprego de produtos químicos e os problemas por eles acarretados, a elaboração de formulações de entomopatógenos vem se destacando nas pesquisas de formas alternativas no combate deste carrapato. Assim o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de formulações oleosas de um produto comercial de M. anisopliae (Metarril WP Organic®) em diferentes concentrações de óleo mineral, sobre ovos, larvas e fêmeas ingurgitadas do carrapato R. microplus. Para realização deste estudo, foram formados oito grupos: um grupo controle aquoso, tratado apenas com água destilada estéril e Tween 80 a 0,1%; um grupo tratado com a suspensão aquosa de Metarril WP Organic®; três grupos controle contendo 1, 3 ou 5% de óleo mineral, e três grupos tratados com as formulações de Metarril WP Organic® contendo 1, 3 ou 5% de óleo mineral. As formulações possuíam a concentração de 108 conídios/mL. O tratamento consistiu na imersão dos espécimes em um ml da suspensão testada durante três minutos. Os parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas foram significativamente alterados pelas formulações oleosas de Metarril WP Organic®, sendo observado um percentual de controle de 97,35% no grupo tratado com a formulação fúngica contendo 5% de óleo mineral. No tratamento de ovos, as formulações oleosas de Metarril WP Organic® reduziram em até 55 vezes a eclosão das larvas quando comparadas aos grupos controle. No tratamento de larvas, a mortalidade foi de 100% no quinto dia após o tratamento com as formulações fúngicas contendo 3 e 5% de óleo mineral. Estes resultados sugerem que as formulações de Metarril WP Organic® contendo 1, 3 ou 5% de óleo mineral são eficientes, in vitro, contra os está- gios de desenvolvimento do carrapato R. microplus

Metarhizium anisopliae: influence of pH on enzyme activity and control of Rhipicephalus microplus ticks

ABSTRACT. Marciano A.F., Coutinho-Rodrigues C.J.B., Perinotto W.M.S., Camargo M.G., Gôlo P.S., Sá F.A., Quinelato S., Freitas M.C., Angelo I.C., Nogueira M.R.S. & Bittencourt V.R.E.P. [Metarhizium anisopliae: influence of pH on enzyme activity and control of Rhipicephalus microplus ticks.] Metarhizium anisopliae: influência do pH na atividade enzimática e no controle de Rhipicephalus microplus. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 37(Supl.1):85-90, 2015. Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, BR 465, Km 47, Seropédica, RJ 23897-970, Brasil. E-mail: [email protected] Rhipicephalus microplus ticks are one of the major agents causing substantial losses to livestock worldwide. In the search for alternative control strategies, both in vitro and in vivo use of the arthropodpathogenic fungus Metarhizium anisopliae has shown promising results against this ectoparasite. During host colonization, protease production by M. anisopliae is considered one important virulence factor once it is directly related to the active penetration process carried by the fungus on the full host cuticle. Nevertheless, limitations as environmental pH may modulate the proteases production and/or activity, as well as, the fungal virulence. The current study aimed evaluate the virulence and total protease activity of M. anisopliae CG 148 sensu lato (s.l.). Fungal aqueous suspensions or 5% mineral oil formulations were used in different pH ranges (5, 7, or 9). Suspensions and formulations were prepared using a pH meter and adjusted to 108 spores mL-1. In the bioassay, four groups were formed for each pH range: the aqueous fungal suspension, the oil-based fungal formulation and their respective controls (aqueous and oil-based), totaling 12 groups. Engorged females were immersed for 3 minutes and maintained under optimal conditions for evaluation of biological parameters. Total protease activity of the artificial medium (after filtration of mycelia) was assessed by azocasein hydrolysis at 72 hours of incubation in minimal medium supplemented with 1% R. microplus cuticle. Oil-based formulations did not yield significant alterations in the fungal virulence or enzyme activity. Nevertheless, the alkaline pH at aqueous suspensions reduced total protease activity and negatively influenced fungal virulence, reducing 1.5 times tick control percent. Based on these results, it is suggested that excessive alkalinity in strictly aqueous media may potentially interfere in the in vitro arthropodpathogenic fungal virulence