Funktionale Charakterisierung der Metalloprotease ADAM17 und ihrer natürlich vorkommenden Varianten

Der Prozess des Ectodomain-Sheddings beschreibt das irreversible Abspalten des extrazellulären Teils von membranständigen Proteinen. So werden unter anderem Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmoleküle, Zytokine oder Rezeptoren von der Zelloberfläche durch Sheddasen, wie zum Beispiel A Disintegrin And Metalloprotease (ADAM) 17, abgespalten. Diese ubiquitär exprimierte Metalloprotease zählt zu den wichtigsten Sheddasen und kann über 80 verschiedene Substrate prozessieren. Dadurch ist ADAM17 in eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, wie die Regeneration, Differenzierung, Immunität, (chronische) Inflammation oder Krebs involviert. Eine strikte Regulation der Aktivierung und Maturierung der Protease ist dabei notwendig, jedoch noch nicht vollständig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten funktionale ADAM17-Varianten charakterisiert und dadurch Erkenntnisse über die posttranskriptionale Prozessierung von ADAM17 gewonnen werden. Dafür wurde das Makrophagen-Vorläufer-Zellsystem (MØP-Zellsystem) etabliert. Dies ist ein physiologischeres Zellsystem zur Analyse von ADAM17, da es auf immortalisierten Immunzellen basiert. Im Zuge dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne und deren Phosphorylierung durch die Polo-like Kinase 2 für die Aktivierung von ADAM17 zu vernachlässigen ist. Im Gegensatz dazu spielt die Abspaltung der Prodomäne durch Furin eine entscheidende Rolle. Die Regulation von Signalwegen ist von großer Bedeutung und führt bei einer Störung zu Krankheiten oder der Entstehung von Krebs. Aufgrund der Beteiligung von ADAM17 an dem EGF-R-Signalwegen über das Shedden des Rezeptors selbst und viele seiner Liganden, wurde diese Protease bereits als wichtiger Faktor in der Entstehung und Progression von Darmkrebs beschrieben. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Aktivität und Maturierung von ADAM17-Mutationen analysiert, die in Tumorgewebe von Darmkrebspatienten gefunden wurden. Dabei zeigten die untersuchten Varianten eine verminderte oder unveränderte ADAM17-Aktivität. Interessanterweise beeinträchtigte eine Mutation in der Prodomäne die Funktion und den Transport von ADAM17 am stärksten. Weitere Ergebnisse lassen vermuten, dass nicht nur die Membran-proximale Domäne in der Substraterkennung involviert ist, sondern auch die katalytische Domäne. Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese, dass ADAM17 über die Regulation von inflammatorischen Prozessen an der Tumorentstehung beteiligt ist. Im letzten Teil der Arbeit wurde das zuvor etablierte MØP-Zellsystem für die Charakterisierung einer Krankheits-assoziierten ADAM17-Variante verwendet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Mutation, die sich in der katalytischen Domäne, aber abseits des aktiven Zentrums, befindet, sowohl die Aktivität als auch den Transport an die Zelloberfläche schwerwiegend beeinträchtigt. Diese Erkenntnisse können als Grundlage für die Suche nach therapeutischen Ansätzen dienen

Functional Characterization of Colon-Cancer-Associated Variants in ADAM17 Affecting the Catalytic Domain

Although extensively investigated, cancer is still one of the most devastating and lethal diseases in the modern world. Among different types, colorectal cancer (CRC) is most prevalent and mortal, making it an important subject of research. The metalloprotease ADAM17 has been implicated in the development of CRC due to its involvement in signaling pathways related to inflammation and cell proliferation. ADAM17 is capable of releasing membrane-bound proteins from the cell surface in a process called shedding. A deficiency of ADAM17 activity has been previously shown to have protective effects against CRC in mice, while an upregulation of ADAM17 activity is suspected to facilitate tumor development. In this study, we characterize ADAM17 variants found in tissue samples of cancer patients in overexpression studies. We here focus on point mutations identified within the catalytic domain of ADAM17 and could show a functional dysregulation of the CRC-associated variants. Since the catalytic domain of ADAM17 is the only region structurally determined by crystallography, we study the effect of each point mutation not only to learn more about the role of ADAM17 in cancer, but also to investigate the structure-function relationships of the metalloprotease

Structural and functional analyses of the shedding protease ADAM17 in HoxB8-Immortalized macrophages and dendritic-like cells

A disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 17 has been implicated in many shedding processes. Major substrates of ADAM17 are TNF-α, IL-6R, and ligands of the epidermal growth factor receptor. The essential role of the protease is emphasized by the fact that ADAM17 deficiency is lethal in mice. To study ADAM17 function in vivo, we generated viable hypomorphic ADAM17 mice called ADAM17ex/ex mice. Recent studies indicated regulation of proteolytic ADAM17 activity by cellular processes such as cytoplasmic phosphorylation and removal of the prodomain by furin cleavage. Maturation and thus activation of ADAM17 is not fully understood. So far, studies of ADAM17 maturation have been mainly limited to mouse embryonic fibroblasts or transfected cell lines relying on nonphysiologic stimuli such as phorbol esters, thus making interpretation of the results difficult in a physiologic context. In this article, we present a robust cell system to study ADAM17 maturation and function in primary cells of the immune system. To this end, HoxB8 conditionally immortalized macrophage precursor cell lines were derived from bone marrow of wild-type and hypomorphic ADAM17ex/ex mice, which are devoid of measurable ADAM17 activity. ADAM17 mutants were stably expressed in macrophage precursor cells, differentiated to macrophages under different growth factor conditions (M-CSF versus GM-CSF), and analyzed for cellular localization, proteolytic activity, and podosome disassembly. Our study reveals maturation and activity of ADAM17 in a more physiological-immune cell system. We show that this cell system can be further exploited for genetic modifications of ADAM17 and for studying its function in immune cells