Metabolic Alterations in Cardiomyocytes of Patients with Duchenne and Becker Muscular Dystrophies

Duchenne and Becker muscular dystrophies (DMD/BMD) result in progressive weakness of skeletal and cardiac muscles due to the deficiency of functional dystrophin. Respiratory failure is a leading cause of mortality in DMD patients; however, improved management of the respiratory symptoms have increased patients’ life expectancy, thereby also increasing the clinical relevance of heart disease. In fact, the prevalence of cardiomyopathy, which significantly contributes to mortality in DMD patients, increases with age and disease progression, so that over 95% of adult patients has cardiomyopathy signs. We here review the current literature featuring the metabolic alterations observed in the dystrophic heart of the mdx mouse, i.e., the best-studied animal model of the disease, and discuss their pathophysiological role in the DMD heart. It is well assessed that dystrophin deficiency is associated with pathological alterations of lipid metabolism, intracellular calcium levels, neuronal nitric oxide (NO) synthase localization, and NO and reactive oxygen species production. These metabolic stressors contribute to impair the function of the cardiac mitochondrial bulk, which has a relevant pathophysiological role in the development of cardiomyopathy. In fact, mitochondrial dysfunction becomes more severe as the dystrophic process progresses, thereby indicating it may be both the cause and the consequence of the dystrophic process in the DMD heart

Molecular analysis of Duchenne/Becker muscular dystrophy

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Caratterizzazione funzionale di mutazioni in geni associati all'ipertermia maligna e al central core disease e identificazione di loci alternativi per l'ipertermia maligna

L'importanza di una fine regolazione della concentrazione di Ca2+ intracellulare nel muscolo scheletrico è evidenziata anche da un gruppo di malattie neuromuscolari associate a mutazioni nel canale del Ca2+ RyR1, localizzato sulle membrane del reticolo sarcoplasmatico: ipertermia maligna (MH), central core disease (CCD) e multi-mini core disease (MmD). Più del 50% dei casi di suscettibilità all'MH (MHS) sono associati a mutazioni in RyR1. Inoltre, altri 5 loci genici alternativi per l'MHS sono stati individuati (MHS2-6). Mutazioni nel gene CACNA1S (locus MHS5), che codifica la subunità alfa1 del canale del Ca2+ voltaggio-dipendente Cav 1.1 o DHPR, sono state identificate in pazienti MHS. Gli scopi di questo progetto di ricerca sono la caratterizzazione funzionale di mutazioni identificate nel gene RYR1 in pazienti italiani con MHS e con CCD, e di una nuova mutazione identificata nel gene CACNA1S e, inoltre, lo studio del coinvolgimento di altri loci genici potenzialmente associati all'MH in famiglie italiane. Gli studi funzionali sui canali RyR1 mutati saranno effettuati in linfociti B immortalizzati e isolati da pazienti portatori di mutazioni di RyR1 in eterozigosi e da soggetti normali (controlli); saranno valutati due parametri: la velocità di secrezione di protoni e il rilascio di Ca2+ in risposta ad agenti attivatori di RyR1. Inoltre saranno eseguiti studi funzionali di canali DHPR per caratterizzare una nuova mutazione del gene CACNa1S identificata in una famiglia italiana con MH. Miotubi generati da linee cellulari GLT omozigoti disgeniche (alfa 1S knock out) di topo saranno transfettate con costrutti marcati con GFP e codificanti la subunità alpha1S di DHPR sia wild type che mutata. In questi sistemi saranno studiate la cinetica delle correnti elettriche evocate dal Ca2+ e il rilascio di Ca2+ indotto dalla caffeina anche in collaborazione con il Prof. M. Grabner dell'Università di Innsbruck. I risultati che si otterranno dalla caratterizzazione funzionale dei canali del Ca2+ mutati potranno fornire informazioni sull'influenza che una data mutazione ha sul comportamento dei canali RyR1 e DHPR e quindi sulla relazione tra struttura e funzione di queste proteine. Inoltre, lo studio dell'influenza di una determinata mutazione sulla struttura e funzione di questi canali del Ca2+ potrebbe fornire anche un considerevole contributo alla diagnosi. Il coinvolgimento di altri loci genici nella MH sarà valutato in famiglie italiane mediante analisi di linkage con marcatori polimorfici adiacenti ai loci MHS già identificati (MHS2-6). Tale analisi sarà condotta in una famiglia in cui sono state escluse mutazioni nel gene RYR1. Questo progetto contribuirà a chiarire le basi molecolari e l'eziopatogenesi di malattie quali MH e CCD e delle loro distinte caratteristiche patofisiologiche (iperattività muscolare farmaco-dipendente nell'MH e debolezza muscolare e sviluppo di "cores" in CCD e MmD), nonchè i meccanismi responsabili dell'accoppiamento eccitazione - contrazion

IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI MUTAZIONI DEL GENE RYR1 ASSOCIATE ALL’IPERTERMIA MALIGNA

Ricerca delle mutazioni nel gene RYR1, associate all’Ipertermia Maligna e loro caratterizzazione strutturale e funzionale mediante saggi in vitro

Influenza delle triplette CGG del gene FRMR1 premutate, intermedie o non interrotte in sindromi neurologiche (atrofia multisistemica cerebellare o MSA-C e atassia cerebellare ad esordio tardivo o ILOCA).

L'espansione delle ripetizioni trinucleotidiche CGG (>200) nella regione 5' non tradotta (5'UTR) del gene FMR1 è la causa prevalente di ritardo mentale ereditario. Le donne portatrici e gli uomini portatori hanno ripetizioni espanse tra 55 e 200 (alleli premutati). La recente identificazione di almeno tre forme di coinvolgimento clinico (FXTAS, POF, ritardo mentale e disordini nello spettro dell'autismo) fra i portatori di premutazioni del gene FMR1 ha fondamentalmente cambiato il modo con cui la comunità scientifica considera questo gruppo di individui. Sulla base di studi su un modello murino in cui le triplette CGG del gene FMR1 endogene sono state sostituite con 98 ripetizioni CGG umane, è stato derivato un modello molecolare per la neuropatologia dell'FXTAS: 1. La lunga ripetizione CGG nel trascritto FMR1 impedisce la migrazione della subunità 40S portando a un blocco della traduzione; 2. In risposta ai più bassi livelli del prodotto proteico FMRP un meccanismo di feedback non ancora identificato incrementa i livelli di specifici fattori di trascrizione con un conseguente aumento della trascrizione del gene FMR1. 3. L'aumento della trascrizione porta ad elevati livelli di mRNA di FMR1; in alternativa, lunghi tratti CGG nel trascritto FMR1 possono sequestrare alte dosi di proteine leganti CGG e i ridotti livelli di queste ultime può a sua volta determinare un aumento della trascrizione del gene FMR1. 4. La cellula nervosa tenta di proteggere se stessa dagli elevati livelli di trascritto del gene FMR1 utilizzando chaperons molecolari e componenti della via di degradazione ubiquitina/proteosoma. Se gli elevati livelli di trascritto del gene FMR1 resistono al ripiegamento/degradazione si formeranno le inclusioni intranucleari. In ultimo, la formazione delle inclusioni innescherà la neurodegenerazione attraverso l'attivazione di pathways di segnali neurotossici. Recentemente è stato inoltre dimostrato che una singola sostituzione nucleotidica (interruzioni AGG) nel tratto ripetuto CGG gioca un ruolo importante nella formazione di strutture secondarie nella regione 5'UTR del gene FMR1. Per questo è stato proposto che sia la lunghezza del tratto CGG che le interruzioni AGG possano avere significative implicazioni cliniche per l'X-fragile e per altre sindromi correlate al gene FMR1. Il ruolo di strutture secondarie nella regione 5'-UTR dell'mRNA di FMR1 può essere particolarmente importante fenotipicamente nei portatori di piccole premutazioni o di lunghi alleli normali. In un modello avanzato il destino dei trascritti di alleli del gene FMR1 con lunghezza elevata nell'ambito della normalità e con brevi premutazioni è considerato fortemente dipendente dal numero e dalla posizione delle interruzioni AGG, cioè dalla struttura della regione 5'-UTR dell'mRNA di FMR1 e non soltanto dalla lunghezza del tratto ripetuto. Lo scopo di questo progetto è la caratterizzazione del numero di ripetizioni CGG e l'organizzazione degli alleli del gene FMR1 e dei relativi livelli dell'mRNA di FMR1 in una popolazione di pazienti con atrofia multisistemica cerebellare (MSA-C) e atassia cerebellare ad esordio tardivo (ILOCA) dell'Italia meridionale. Questa analisi ci permetterà di valutare il ruolo della lunghezza delle ripetizioni CGG e della loro organizzazione (numero e della posizione delle interruzioni AGG) sulla struttura e sui livelli dei relativi mRNA di FMR1 in questi disordini neurologici e ci permetterà inoltre di avanzare correlazioni fra genotipo e fenotipo