Catabolism of caffeine and purification of a xanthine oxidade responsible for methyluric acids production in Pseudomonas putida L Catabolismo de cafeína e purificação de xantina oxidase responsável pela produção de ácidos metilúricos em Pseudomonas putida L

Caffeine catabolism and a xanthine oxidase involved in the alkaloid breakdown were studied in Pseudomonas putida L, a strain displaying high ability to grow on this substrate. Cells cultured with unlabelled caffeine and 14C labeled caffeine and xanthine showed that this alkaloid was broken-down via theobromine/paraxanthine -> 7-methylxanthine -> xanthine -> uric acid -> allantoin -> allantoic acid. Methyluric acids were formed from the oxidation of theobromine, paraxanthine and 7-methylxanthine, although no bacterial growth was observed on these compounds, indicating that this might be due to a wide substrate specificity of xanthine oxidase. This was confirmed by activity staining in PAGE where activity was observed with theophylline and 3-methylxanthine, which are not involved in the alkaloid breakdown. A single band of activity was detected without addition of NAD+, showing an oxidase form of the enzyme. The enzyme optimum temperature and pH were 30oC and 7.0, respectively. The determined Km was 169 µM, and the pI 3.1 - 4.0. The molecular weight determined by side by side comparison of activity staining of the enzyme in PAGE and PAGE of BSA was 192 kDa, which was coincident with the sum (198.4 kDa) of three subunits (71, 65.6 and 61.8 kDa) of the purified protein.<br>O catabolismo de cafeína e a enzima xantina oxidase, envolvida na sua degradação, foram estudados em Pseudomonas putida L, uma linhagem com alta capacidade para utilizar este substrato como fonte de energia. Células crescidas na presença de cafeína e xantina marcadas com 14C, e cafeína não marcada, mostraram que este alcalóide foi degradado via teobromina/paraxantina -> 7-metilxantina -> xantina -> ácido úrico -> alantoína -> ácido alantóico. Ácidos metilúricos foram formados a partir de teobromina, paraxantina e 7-metilxantina, embora nenhum crescimento bacteriano ter sido observado quando estes compostos foram usados como substratos, indicando que a xantina oxidase possui um ampla especificidade para substratos. Isto foi confirmado por detecção de atividade em gel não desnaturante (PAGE), tendo sido observada atividade para teofilina e 3-metilxantina, que não estão envolvidas na degradação de cafeína. Uma única banda de atividade foi observada em (PAGE) quando NAD+ não foi incluído no meio de incubação, indicando ser a enzima uma oxidase. A temperatura ótima e o pH ótimo da reação para a enzima foram 30oC e 7,0, respectivamente. O Km determinado foi de 169 µM, e o pI 3.1 - 4.0. A massa molecular determinada através da comparação lado a lado de gel de atividade em PAGE e PAGE de padrão de albumina de soro bovino foi de 192 kDa, que foi coincidente com a soma (198,4 kDa) de três subunidades (71, 65,6 e 61,8 kDa) da enzima purificada