Mise en conformité d'un procédé de conservation de tissu autologue (peau à + 4 C)

LYON1-BU Santé (693882101) / SudocSudocFranceF

Characterization of a Topically Testable Model of Burn Injury on Human Skin Explants

International audienceSevere burn injuries remain a major health problem due to high rates of mortality, residual morbidity, and/or aesthetic damages. To find new therapies aimed at promoting a harmonious healing of skin burns, it is important to develop models which take into account the unique properties of the human skin. Based on previously described models of burn injury performed on human skin explants, we hypothesized that maintaining explants under constant tension forces would allow to more closely reproduce the pathophysiological processes of skin remodeling. We thus. Here, we set up and characterized an improved model of deep second-degree burn injury on ex vivo cultured human skin explants at air-liquid interface and maintained under conditions of constant tension forces. A spontaneous re-epithelialization of the lesion was observed 8 to 9 days post burn and was found to rely on the proliferation of basal keratinocytes at the wound edges. Collagen VII at the dermo-epidermal junction reformed along with the progression of re-epithelializatio and a synthesis of procollagen III was observed in the dermis at the wound site. These findings indicate that our model is suitable for the assessment of clinically-relevant therapies aimed at modulating the kinetics of re-epithelialization and/or the activation of fibroblasts following skin burn injuries. In this regard, we evaluated the use of a thermoreversible poloxamer hydrogel as a vehicle for topically-testable therapeutic molecules. Our data showed that, although useful for drug formulation, the p407/p188 poloxamer hydrogel induces a delay of skin re-epithelialization in humans skin explants submitted to experimental burn injury

Obésité et cellules myoépithéliales : nouveau tandem impliqué dans la cancérogenèse mammaire ?

International audienceLe cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes dans le monde. La surcharge pondérale et l'obésité sont désormais reconnues comme des facteurs de risque établis de cette pathologie chez les femmes ménopausées et sont également considérées comme responsables de taux de récurrence et de mortalité plus élevés. Des interactions réciproques ont été décrites entre les cellules adipeuses et cancéreuses, favorisant une plus grande prolifération des cellules cancéreuses, leur invasion et même leur résistance aux traitements anticancéreux. En outre, l'inflammation chronique de bas grade observée chez les personnes obèses amplifierait ces processus. Parmi l’ensemble des types cellulaires présents dans le sein, les cellules myoépithéliales (CME), situées à l'interface des cellules épithéliales et du stroma, sont considérées comme des cellules "suppressives de tumeurs". Lors de la transition d'un carcinome canalaire in situ à un cancer invasif, une désorganisation voire une disparition des CME est observée, renforçant la capacité des cellules cancéreuses à migrer. Le microenvironnement adipeux étant un acteur central dans la progression du cancer du sein, notre objectif était d'évaluer s'il pouvait être impliqué dans les modifications fonctionnelles des CME en particulier chez les patients obèses. Grâce à un modèle de co-culture, nous avons étudié l'impact des cellules souches adipeuses humaines (hASC) (lignée hMAD ou hASC provenant de femmes de poids normal (hASC20) ou obèses (hASC30)), différenciées ou non en adipocytes matures (AM20, AM30), sur la fonctionnalité des CME (lignée Hs578Bst) en mesurant les modifications de la prolifération, de l'apoptose, de l'expression des gènes (32 gènes, n=6) et des miARN (384 miRNA). En présence des hASC et des AM, une diminution de la viabilité des CME est observée (-23%,-10% avec hMAD et hASC respectivement, p<0,05;-11% avec AM, p<0,01) associée à une légère augmentation de l'apoptose. Les cellules adipeuses extraites de femmes normopondérées semblent favoriser la viabilité des CME par rapport à celles provenant de femmes obèses (-13% avec hASC20;-8% avec hASC30;-16% avec AM20,p<0,01;-8% avec AM30,ns). Le microenvironnement adipeux a également entrainé de nombreuses modifications d'expression de gènes impliqués dans le maintien de la matrice extracellulaire et amplifié l'expression de la leptine et des marqueurs inflammatoires (IL6, COX2, TNF). Enfin, 2 miRNA apparaissent comme des cibles potentielles des cellules adipeuses : miR-122-5p et miR-132-3p. Ces résultats confirment l’implication des cellules adipeuses et de leur sécrétome dans la perte de fonctionnalité des CME. Toutes ces perturbations pourraient donc être responsables de la perte du statut de suppresseur de tumeur des CME et favoriser le passage d'un carcinome in situ à un carcinome invasif particulièrement chez les patientes obèses.Projet financé par la Fondation ARC pour la recherche sur le cance

NaHS-Hydrogel and Encapsulated Adipose-Derived Stem Cell Evaluation on an Ex Vivo Second-Degree Burn Model

Second-degree burns result in the loss of the epidermal barrier and could lead to delayed complications during the healing process. Currently, therapeutic options to treat severe burns are limited. Thus, this work aims to evaluate the effect of NaHS, a hydrogen sulfide (H2S) donor, in poloxamer hydrogel in topical application and the potentiating effect of injected encapsulated adipose-derived stem cells (ASCs) compared to monolayer ASCs using our previous second-degree burn model on human skin explants. Indeed, our model allows testing treatments in conditions similar to a clinical application. The observed benefits of NaHS may include an antioxidant role, which might be beneficial in the case of burns. Concerning ASCs, their interest in wound healing is more than well documented. In order to evaluate the efficiency of our treatments, we analyzed the kinetics of wound closure, keratinocyte proliferation, and dermal remodeling. The effect of NaHS led to a delay in re-epithelialization, with a decrease in the number of proliferating cells and a decrease in the synthesis of procollagen III. On the contrary, intradermal injection of ASCs, encapsulated or not, improves wound healing by accelerating re-epithelialization and collagen I synthesis; however, only encapsulated ASCs accelerate keratinocyte migration and increase the rate of procollagen III and collagen III. In conclusion, NaHS treatment did not improve burn healing. However, the injection of ASCs stimulated wound healing, which is encouraging for their therapeutical use in burn treatment

Adipose cells could favor breast cancer invasion by inducing the loss of the tumor-suppressor profile of mammary myoepithelial cells

Obesity is responsible for higher recurrence and mortality breast cancer (BC) rates. Of all the cell types present in the breast, myoepithelial cells (MyoEpCs) are considered "tumor suppressors". During the transition from in situ to invasive ductal BC, a disorganization of MyoEpCs is observed that promotes the ability of cancer cells to migrate. As the adipose microenvironment could promote BC, we would like to characterize its role on the functionality of MyoEpCs in an obese context.For this purpose, MyoEpCs (Hs 578Bst) were co-cultured with human adipose stem cells (hASC) (hMAD cell line and hASCs from healthy women). We found that the viability of MyoEpCs was reduced in the presence of hASC (-23%, -10% with hMAD and hASC respectively, p<0.05) associated with a slight increase in apoptosis. When hASC were differentiated into mature adipocytes (MA), the same impact on viability was observed (-11%, p<0.01). The influence of obesity was evaluated using hASC from thin or obese patients (hASC20, hASC30) differentiated into MA (MA20, MA30). Cells of obese women had slightly less activity on MyoEpCs viability (-13% with hASC20; -8% with hASC30; -16% with MA20, p<0.01; -8% with MA30, ns). Adipose secretome alone had less important effects on MyoEpCs, highlighting the importance of cell-cell interactions.MyoEpCs co-cultured with MA expressed significantly less AdipoR1 (RQ=0.7) and CDH1 (RQ=0.3), suggesting a loss of functionality of MyoEpCs. In addition, an increase in the expression of genes normally poorly or not expressed by MyoEpCs was observed. These preliminary results confirmed that adipose cells and their secretome could influence the behavior of MyoEpCs and lead to the loss of the "tumor suppressor" status. A 3D organoids model is being developed to evaluate the influence of adipose secretome on the structure and functionality of MyoEpCs and will identify new preventive and therapeutic targets for BC

Les cellules adipeuses pourraient favoriser l'invasion du cancer du sein en induisant la perte du profil suppresseur de tumeur des cellules myoépithéliales mammaires

Cet évènement s’inscrit dans le cadre du partenariat établi entre le réseau NACRe et la Fondation ARC. Ce sera également l’occasion de marquer les 20 ans du Réseau NACRe.L'obésité, facteur de risque établi de cancer du sein chez les femmes ménopausées, est aussi responsable de taux plus élevés de récidives et de mortalité. Parmi l’ensemble des types cellulaires présents dans le sein, les cellules myoépithéliales (CME), situées à l’interface des cellules épithéliales et du stroma, sont considérées comme des cellules "suppressives de tumeurs". Au cours de la transition d’un carcinome canalaire in situ (CCIS) vers un cancer invasif, une désorganisation voire une disparition des CME est observée, favorisant ainsi la capacité des cellules cancéreuses à migrer. Le microenvironnement adipeux, étant désormais considéré comme un acteur central de la progression du cancer mammaire, notre objectif était d’évaluer son rôle sur la fonctionnalité des CME dans un contexte d’obésité.Méthodes Des CME (Hs 578Bst) ont été co-cultivées en présence i/de cellules souches adipeuses humaines (hASC) (lignée cellulaire hMAD, hASC de patientes normopondérées ou obèses [hASC20,hASC30]) différenciées en adipocytes matures (AM20,AM30) ou ii/des différents sécrétomes adipocytaires (SA). Après 72h, la prolifération, l’apoptose et les modifications d’expression de gènes (32 gènes,n=6) impliqués dans la prolifération, l’invasion et l’adhésion cellulaire ont été étudiées. En parallèle, un modèle de sphéroïdes tumoraux multicellulaires nommé «TRIMISTIC» (TRIdimensional Model of In Situ To Invasive Carcinoma) a été développé afin de reproduire un modèle multigrade d’évolution des cancers mammaires dans lequel les interactions entre les CME et les cellules épithéliales pourront être évaluées en présence de SA.Résultats En présence des hASC et des AM, une diminution de la viabilité des CME est observée (-23%,-10% avec hMAD et hASC respectivement,p<0,05;-11% avec AM,p<0,01) associée à une légère augmentation de l'apoptose. Les cellules adipeuses extraites de femmes normopondérées semblent favoriser la viabilité des CME par rapport à celles provenant de femmes obèses (-13% avec hASC20;-8% avec hASC30;-16% avec AM20,p<0,01;-8% avec AM30,ns). L’impact du sécrétome adipeux seul semble, quant à lui, présenter des effets moindres sur les CME.Les CME co-cultivées avec les AM expriment significativement moins AdipoR1 (RQ=0,7) et CDH1 (RQ=0,3), suggérant une perte de fonctionnalité de ces cellules. De plus, une augmentation de l'expression des gènes normalement peu ou pas exprimés par les CME a été observée (leptine, IL6, TNFα, fibronectine1). La mise au point du modèle TRIMISTIC a été réalisée et va permettre l’étude de l’influence des SA en fonction du statut in situ ou invasif des sphéroïdes.Conclusions et perspectivesCes résultats préliminaires confirment l’implication des cellules adipeuses et de leur sécrétome dans la perte de fonctionnalité des CME. Le modèle de sphéroïdes permettra d’évaluer l'influence des SA sur l’interaction CME-CCIS et d’identifier de nouvelles cibles préventives et thérapeutiques

Validation of an implantable bioink using mechanical extraction of human skin cells: First steps to a 3D bioprinting treatment of deep second degree burn

International audienceClinical grade cultured epithelial autograft (CEA) are routinely used to treat burns covering more than 60% of the total body surface area. However, although the epidermis may be efficiently repaired by CEA, the dermal layer, which is not spared in deep burns, requires additional treatment strategies. Our aim is to develop an innovative method of skin regeneration based on in situ 3D bioprinting of freshly isolated autologous skin cells. We describe herein bioink formulation and cell preparation steps together with experimental data validating a straightforward enzyme-free protocol of skin cell extraction. This procedure complies with both the specific needs of 3D bioprinting process and the stringent rules of good manufacturing practices. This mechanical extraction protocol, starting from human skin biopsies, allows harvesting a sufficient amount of both viable and growing keratinocytes and fibroblasts. We demonstrated that a dermis may be reconstituted in vitro starting from a medical grade bioink and mechanically-extracted skin cells. In these experiments, proliferation of the extracted cells can be observed over the first 21 days period after 3D bioprinting and the analysis of type I collagen exhibited a de novo production of extracellular matrix proteins. Finally, in vivo experiments in a murine model of severe burn provided evidences that a topical application of our medical grade bioink was feasible and well-tolerated. Overall, these results represent a valuable groundwork for the design of future 3D bioprinting tissue engineering strategies aimed at treating, in a single intraoperative step, patients suffering from extended severe burns

Cancer du sein et obésité: impact du microenvironnement adipeux sur la fonctionnalité des cellules myoépithéliales

National audienceIntroduction et but de l’étude: L'obésité est reconnue comme un facteur de risque de cancer du sein chez les femmes ménopausées, également responsable de taux plus élevés de récidive et de mortalité. Parmi l’ensemble des types cellulaires présents au niveau du sein, les cellules myoépithéliales (CME), peu étudiées à ce jour, forment une monocouche séparant les cellules épithéliales de la membrane basale et sont considérées comme des "suppresseurs de tumeurs" qui favorisent l'inhibition de la croissance tumorale, de l'invasion ou de l'angiogenèse. Au cours de la transition d’un carcinome canalaire in situ (CCIS) en carcinome canalaire invasif (CCI), une désorganisation voire une disparition complète des CME est observée, ce qui augmente la capacité de migration des cellules cancéreuses. Lee microenvironnement adipeux étant actuellement reconnu comme un élément favorisant la carcinogenèse mammaire, nous avons souhaité caractériser son rôle sur la disparition et la fonctionnalité des cellules myoépithéliales, et ce, plus particulièrement, dans un contexte d'obésité. Matériel et méthodes: Pour cela, des CME (Hs 578Bst) ont été co-cultivées en présence de lignées de cellules souches adipeuses (ASC) (hMAD, 3T3F442a) ou d’ASC obtenues à partir de patientes minces ou obèses, et différenciées par la suite en adipocytes matures (AM). Après 72h de co-culture, la prolifération des CME a été mesurée par un test fluorescent à la résazurine (Fluoroskan Ascent FL®) et l'apoptose évaluée (annexine V-FITC/PI). En parallèle, un modèle de culture tridimensionnelle de sphéroïdes a été développé afin d’évaluer l'influence du secrétome adipocytaire sur la structure et la fonctionnalité des CME. Résultats et Analyse statistique : En présence de hMAD différenciées ou non en AM, une diminution significative de la viabilité des CME (-22%, n=4, p=0,05 ; -11%, n=3, p=0,01 respectivement) associée à une tendance à l’augmentation de l’apoptose a été montrée. Une diminution non significative de la prolifération des CME est observée en présence des cellules adipeuses 3T3-F442A alors qu’aucun effet n’est observé en présence des ASC prélevées sur des femmes minces et obèses. Conclusion: Ces résultats préliminaires montrent que les cellules adipeuses et leurs sécrétions influencent le comportement des CME. Les modèles de co-culture et de sphéroïdes développés avec les CME permettront d’avoir une meilleure compréhension de l’influence du surpoids et de l’obésité sur la fonctionnalité de ces cellules, et afin, à terme, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et préventives du cancer du sein. Remerciements: Projet financé par la Fondation ARC pour la recherche sur le cance

Rôle du secretome adipocytaire dans la resistance au traitement par hormonotherapie et sur les cellules souches cancereuses : cas du cancer mammaire en situation d’obésité

L’obésité est désormais reconnue comme un facteur de risque de développement de cancer du sein chez les femmes ménopausées, mais elle est également responsable d’une augmentation du risque métastatique, de récidives et du taux de mortalité. Nos travaux consistent à déterminer l’impact des sécrétions adipocytaires dans l’augmentation du risque de mortalité observée en situation d’obésité en nous focalisant sur le processus de résistance au traitement d’hormonothérapie par Tamoxifène (Tx) ainsi que sur le comportement des cellules souches cancéreuses (CSC) mammaires, dont le rôle dans la résistance aux traitements est désormais soulevé. Pour cela, i/ la prolifération des cellules cancéreuses mammaires (MCF-7) en présence de Tx et de milieux conditionnés provenant de la culture d’adipocytes matures (AM) issus de la différentiation in vitro de cellules souches adipocytaires prélevées sur des femmes normopondérées (AM20) ou obèses (AM30) a été évaluée. ii/ Un modèle original de culture 3D entre « MCF-7-fibroblastes-AM20 ou AM30 » a été mis au point en présence ou non de Tx. La mesure de l’expression de 42 gènes (impliqués dans l’angiogenèse, les voies cytokiniques et hormonales, la prolifération cellulaire) a été réalisée. iii/ Après avoir caractérisé et isolé les cellules souches cancéreuses (CSC), l’impact de traitements anti-cancéreux d’hormonothérapie ou de chimiothérapie et de deux adipokines a été évalué sur la prolifération des CSC mammaires MCF-7. Le secrétome pourrait intervenir dans la réponse à la thérapie puisqu’une diminution de l’efficacité du Tx est retrouvée en présence des milieux conditionnés d’AM30 dans nos différents modèles. Des profils d’expression des MCF7 différents ont pu être définis en fonction de leur exposition au Tx et/ou aux AM30. Concernant l’étude des CSC, les cellules isolées voient leur prolifération augmenter en présence des traitements anti-cancéreux mais également en présence de leptine et d’IL-6. Ainsi, le secrétome adipocytaire pourrait être directement impliqué dans l’augmentation de mortalité décrite en situation de surpoids et de cancer du sein en diminuant l’efficacité des traitements anticancéreux d’hormonothérapie tels que le tamoxifène. De plus, nos premiers travaux suggèrent que ces sécrétions pourraient aussi jouer un rôle dans le comportement des CSC, ce qui ouvre des perspectives préventives et/ou thérapeutiques intéressantes en termes de prise en charge des patientes en surcharge pondéral

Influence du sécrétome adipocytaire dans la résistance aux traitements anticancéreux à l’aide d’un modèle d’organoïdes pluricellulaires TRIMISTIC

L'obésité est aujourd’hui considérée comme un facteur de risque de cancer du sein chez les femmes ménopausées et est aussi responsable de plus forts taux de récidives et de mortalité. Dans ce contexte, notre équipe a mis en évidence une moindre efficacité des traitements anticancéreux par hormonothérapie à l’aide de différents modèles : i/ un modèle de co-cultures entre cellules cancéreuses mammaires et cellules souches adipeuses prélevées chez des femmes normopondérées ou obèses et différenciées en adipocytes matures ; ii/ un modèle tridimensionnel de peau reconstruite adipeuse permettant de récréer un véritable microenvironnement adipeux [1,2]. Notre objectif est désormais d’évaluer le rôle du sécrétome adipocytaire dans la résistance aux thérapies anticancéreuses à l’aide d’un nouveau modèle 3D d’organoïdes appelé TRIMISTIC (TRIdimensional Multigrade In Situ To Invasive Cancer) consistant en la réalisation d’un modèle pluricellulaire multigrade d’évolution des cancers mammaires d’une structure bénigne vers une structure invasive en passant par le stade in situ.Afin de s’affranchir de la présence de facteurs de croissance, des cellules cancéreuses (MCF-7, MCF10-DCIS) ou non cancéreuses mammaires (MCF10a) sont ensemencées dans un système sans matrice dans lequel les cellules ne peuvent adhérer au support. Après 72h de culture, les sphéroïdes obtenus sont mis au contact des cellules myoépithéliales pendant 24h afin d’obtenir des organoïdes pluricellulaires. L’impact du sécrétome adipocytaire sur l’efficacité de traitements anticancéreux est ensuite évalué sur la viabilité cellulaire et l’organisation cellulaire à l’aide de marqueurs spécifiques de chaque type cellulaire.La mise au point de ce modèle nécessite des expérimentations complémentaires qui nous permettront de mieux appréhender les interactions entre cellules mammaires et le sécrétome adipocytaire ainsi que les mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux, l’objectif final étant d’évaluer la réponse thérapeutique à l’aide de cellules cancéreuses de patientes.1. L. Bougaret, L. Delort, H. Billard, C. Le Huede, C. Boby, A. De la Foye, A. Rossary, A. Mojallal, O. Damour, C. Auxenfans, M. P. Vasson, and F. Caldefie-Chezet, PLoS ONE 13, e0191571 (2018).2. L. Delort, C. Lequeux, V. Dubois, A. Dubouloz, H. Billard, A. Mojallal, O. Damour, M.-P. Vasson, and F. Caldefie-Chézet, PLoS ONE 8, e66284 (2013)