Allelic Dropout Is a Common Phenomenon That Reduces the Diagnostic Yield of PCR-Based Sequencing of Targeted Gene Panels

Primary cardiomyopathies (CMPs) are monogenic but multi-allelic disorders with dozens of genes involved in pathogenesis. The implementation of next-generation sequencing (NGS) approaches has resulted in more time- and cost-efficient DNA diagnostics of cardiomyopathies. However, the diagnostic yield of genetic testing for each subtype of CMP fails to exceed 60. The aim of this study was to demonstrate that allelic dropout (ADO) is a common phenomenon that reduces the diagnostic yield in primary cardiomyopathy genetic testing based on targeted gene panels assayed on the Ion Torrent platform. We performed mutational screening with three custom targeted gene panels based on sets of oligoprimers designed automatically using AmpliSeq Designer® containing 1049 primer pairs for 37 genes with a total length of 153 kb. DNA samples from 232 patients were screened with at least one of these targeted gene panels. We detected six ADO events in both IonTorrent PGM (three cases) and capillary Sanger sequencing (three cases) data, identifying ADO-causing variants in all cases. All ADO events occurred due to common or rare single nucleotide variants (SNVs) in the oligoprimer binding sites and were detected because of the presence of �marker� SNVs in the target DNA fragment. We ultimately identified that PCR-based NGS involves a risk of ADO that necessitates the use of Sanger sequencing to validate NGS results. We assume that oligoprimer design without ADO data affects the amplification efficiency of up to 0.77 of amplicons. © Copyright © 2021 Shestak, Bukaeva, Saber and Zaklyazminskaya

Сочетание аритмогенной дисплазии правого желудочка и некомпактного миокарда левого желудочка как особая форма кардиомиопатии: клиника, диагностика, генетическая природа, течение

Background. A few cases of combination of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy (ARVC) with left ventricular noncompaction (LVNC) have been described. Aims to study the genetics, diagnostical features and clinical course of the combination of ARVC with LVNC. Methods. 58 patients with ARVC diagnosis (26 men; mean age 39.1 14.2 years; mean follow-up period 21.5 [6; 60] months) and 125 patients with LVNC (74 men; mean age 46.4 15.1 years; mean follow-up period 14 [3; 40] months). All patients underwent electrocardiogram (ECG), echocardiography, 24-h ECG monitoring. Heart MRI was performed in 53 (91.4%) patients with ARVC and 60 (48%) with LVNC, heart CT in 18 (31%) patients with ARVC and 89 (71.2%) with LVNC. For all patients with combination of ARVC and LVNC DNA-diagnostic was performed using both ARVC (PKP2, DSG2, DSP, DSC2, JUP, TMEM43, TGFB3, PLN, LMNA, DES, CTTNA3, EMD, SCN5A, LDB3, CRYAB, FLNC) and LVNC (MYH7, MYBPC3, TAZ, TPM1, LDB3, MYL2, MYL3, ACTC1, TNNT2, TNI3) gene panels. Results. Combination of ARVC and LVNC was found in 9 patients (15.5% of patients form ARVC cohort and 7.2% from LVNC cohort). These patients were distinguished from patients with isolated ARVC or LVNC by aggressive ventricular arrhythmias (frequent premature ventricular beats, sustained ventricular tachycardia, significantly worse antiarrhythmic therapy effect, appropriate shocks of implanted cardioverter-defibrillators (ICD) in all patients with ICD). Patients with combination of ARVC + LVNC were also distinguished from patients with isolated LVNC by the dilatation of RV, low QRS voltage on ECG, presence of AV block, absence of signs of LV hypertrophy on ECG. LV dilatation with reduction of its ejection fraction distinguished patients with mixed cardiomyopathy from patients with isolated ARVC. Potentially pathogenic variants (IVV classes of pathogenicity) and variants of unclear clinical significance (III class of pathogenicity) were found in both desmosomal and non-desmosomal genes in 78% of patients, including 3 (33%) in DSP gene. Conclusions. The combination of ARVC and LVNC can be caused by mutations in both desmosomal and non-desmosomal genes and has typical features: aggressive, resistant ventricular rhythm abnormalities leading to appropriate ICD shocks and a high risk of sudden cardiac death.Обоснование. В литературе описаны лишь единичные случаи сочетания аритмогенной дисплазии правого желудочка (ПЖ) и некомпактного миокарда левого желудочка (ЛЖ). Цель исследования изучить генетическую природу, диагностические признаки и клиническое течение сочетания аритмогенной дисплазии ПЖ и некомпактного миокарда ЛЖ. Методы. 58 пациентов с диагнозом аритмогенная дисплазия ПЖ (26 мужчин; средний возраст 39,1 14,2 года; средний срок наблюдения 21,5 [6; 60] мес) и 125 пациентов с диагнозом некомпактный миокард ЛЖ (74 мужчины; средний возраст 46,4 15,1 года; средний срок наблюдения 14 [3; 40] мес). Всем пациентам выполнены ЭКГ, эхокардиография, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру. МРТ сердца выполнена 53 (91,4%) пациентам с аритмогенной дисплазией ПЖ и 60 (48%) с некомпактным миокардом ЛЖ, МСКТ сердца 18 (31%) пациентам с аритмогенной дисплазией ПЖ и 89 (71,2%) с некомпактным миокардом ЛЖ. Всем пациентам с сочетанием аритмогенной дисплазии ПЖ и некомпактного миокарда ЛЖ проведен поиск мутаций с применением панелей генов аритмогенной дисплазии ПЖ (PKP2, DSG2, DSP, DSC2, JUP, TMEM43, TGFB3, PLN, LMNA, DES, CTTNA3, EMD, SCN5A, LDB3, CRYAB, FLNC) и некомпактного миокарда ЛЖ (MYH7, MYBPC3, TAZ, TPM1, LDB3, MYL2, MYL3, ACTC1, TNNT2, TNNI3). Результаты. Сочетание аритмогенной дисплазии ПЖ и некомпактного миокарда ЛЖ выявлено у 9 больных, что составило 15,5% пациентов в когорте аритмогенной дисплазии ПЖ и 7,2% пациентов в когорте с некомпактным миокардом ЛЖ. Этих пациентов отличают от больных с изолированной аритмогенной дисплазией ПЖ или изолированным некомпактным миокардом ЛЖ агрессивные желудочковые нарушения ритма (частая желудочковая экстрасистолия, устойчивая желудочковая тахикардия с достоверно худшим эффектом антиаритмической терапии, адекватные срабатывания имплантированного кардиовертера-дефибриллятора отмечены у всех больных с имплантированным кардиовертером-дефибриллятором). От пациентов с изолированным некомпактным миокардом ЛЖ больных со смешанной кардиомиопатией отличали также увеличение ПЖ по данным эхокардиографии, снижение вольтажа QRS на ЭКГ, наличие АВ-блокады, отсутствие признаков гипертрофии ЛЖ на ЭКГ. Дилатация ЛЖ со снижением его фракции выброса отличала пациентов со смешанной кардиомиопатией от больных с изолированной аритмогенной дисплазией ПЖ. Потенциально патогенные варианты (IVV классов патогенности) и варианты неясного клинического значения (III класс патогенности) обнаружены как в десмосомных, так и в недесмосомных генах у 78% пациентов, в том числе у 3 (33%) в гене DSP. Заключение. Сочетание аритмогенной дисплазии ПЖ и некомпактного миокарда ЛЖ встречается чаще, чем принято считать, может быть обусловлено мутациями как в десмосомных, так и в недесмосомных генах и обладает характерными особенностями, такими как агрессивные, резистентные к терапии желудочковые нарушения ритма, приводящие к адекватным срабатываниям имплантированного кардиовертера-дефибриллятора, и высокий риск внезапной сердечной смерти