Die Rolle des Signalpeptids für die Reifung des Lassavirus Glykoproteins

Das Oberflächenglykoprotein des Lassavirus ist ein Typ 1-Membranprotein. Es wird als Vorläufer präGP-C synthetisiert und posttranslational mit N-Glykanen modifiziert. Nach der proteolytischen Abspaltung des Signalpeptids wird GP-C in seine beiden Untereinheiten GP1 und GP2 durch die Wirtszellprotease SKI-1/S1P prozessiert. Das Glykoproteins weist nach Analyse mit einem Computerprogramm ein SP von außergewöhnlicher Länge auf. Thema dieser Arbeit war die Charakterisierung dieses SP. 1. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die exakte Länge des Signalpeptids von 58 Aminosäureresten durch N-terminale Sequenzierung der GP1-Untereinheit und Mutationsanalysen der potentiellen Signalpeptidspaltstelle ermittelt. 2. Topologische Untersuchungen ergaben, dass das Signalpeptid des Lassavirus Glykoproteins eine außergewöhnliche Struktur mit zwei hydrophoben Regionen besitzt. Daraus ergeben sich mehrere Möglichkeiten für die Topologie des Signalpeptids in der ER-Membran. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass nur die N-terminale der beiden hydrophoben Domänen die ER-Membran durchspannt und damit ein außergewöhnlich langer Abschnitt, der auch die zweite hydrophobe Region umschließt, im ER-Lumen vorliegt. 3. Das Signalpeptid wurde auf zusätzliche Funktionen neben der Translokationsfunktion untersucht. Hierfür wurde das native Signalpeptid durch andere Signalpeptide ausgetauscht. Dieser Austausch verhindert die Reifespaltung des Glykoproteins GP-C in seine beiden Untereinheiten GP1 und GP2. Die Spaltung wird durch Koexpression des solitären ursprünglichen Signalpeptids wiederhergestellt. Mithilfe von Mutationsanalysen wurde der Bereich des Signalpeptids, der für die proteolytische Aktivierung des Glykoproteins essentiell ist, auf den ER-luminalen Anteil des Signalpeptids eingeschränkt. Weiterhin wurde gezeigt, dass besonders der Bereich zwischen beiden hydrophoben Regionen für die Reifung des Glykoproteins notwendig ist. Über Kopräzipitationsstudien wurde eine direkte Interaktion zwischen Signalpeptid und Glykoprotein bestätigt. Diese wird über eine Wechselwirkung des Signalpeptids mit der GP2-Untereinheit des Glykoproteins vermittelt. 4. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das Signalpeptid ein fester Bestandteil des Virions ist. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Inkorporation des Signalpeptids von der Inkorporation des Glykoproteins abhängig ist und das Signalpeptid selbst keine 5. Die Signalpeptide der Glykoproteine der Arenaviren sind homolog, eine Austauschbarkeit der Signalpeptide zwischen den Glykoproteinen der Arenaviren wurde in der vorliegenden Arbeit bestätigt. Die vorgestellten Daten sind daher auf die Signalpeptide der Glykoproteine aller Arenaviren übertragbar

On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase from Clostridium difficile

Die Gene ldhA und hadA aus Clostridium difficile (DSMZ 1296T) wurden kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden gereinigt und als D-2-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase (LdhA) und 2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase (HadA) identifiziert. Die Enzyme katalysieren zwei Schritte in der Fermentation von Leucin zu Ammonium, CO2, Isovalerat und Isocaproat. Die nächsten im Genom von C. difficile liegenden Gene hadBC und hadI wurden ebenfalls aktiv exprimiert und als 2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase (HadBC) und ihrem Aktivator (HadI) identifiziert. Die Dehydratase katalysiert die Eliminierung von Wasser aus (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA zu Isocaprenoyl-CoA, die eine chemisch schwierige Reaktion darstellt, da das Proton in der b-Position nicht aktiviert ist (pK ca. 40). Wir postulieren, dass erst die Reduktion des Substrats mit einem Elektron die Eliminierung ermöglicht, wobei der pK mindestens bis 14 gesenkt wird. Anschließend wird das Elektron wieder ans Enzym zurückgegeben. Die heterodimere Dehydratase und der homodimere Aktivator sind Eisen-Schwefel-Proteine, in denen keine weiteren prosthetischen Gruppen (oder Metalle wie Molybdän) detektiert werden konnten. Der durch Ferredoxin reduzierte Aktivator überträgt unter ATP-Hydrolyse ein Elektron auf die Dehydratase, die dadurch in den katalytisch aktiven Zustand überführt wird. Dieser ATP-getriebene Elektronen-Transfer ähnelt dem der Nitrogenase. Die aktivierte und vom Aktivator abgetrennte Dehydratase katalysiert ca. 10000 Umsätze bis das Elektron durch Oxidation verloren geht. Durch anschließende Zugabe von ATP und Aktivator kann die inaktivierte Dehydratase wieder voll aktiviert werden. Die Bildung eines stabilen aktiven AlF4--induzierten Komplexes aus Dehydratase und Aktivator stützt den postulierten Elektronentransport vom Aktivator zur Dehydratase und zeigt ebenfalls die Rückgewinnung des benötigten Elektrons nach jedem Turnover. In Übereinstimmung damit werden zur maximalen Aktivität nur substöchiometrische Mengen an Aktivator (Aktivator/Dehydratase = 1:10) benötigt. Mit Hilfe der EPR-Spektroskopie wurde zum ersten Mal während der Dehydratisierung eines 2-Hydroxyacyl-CoA-Derivats ein organisches Radikalsignal detektiert. Mit Hilfe von isotopmarkierten Substraten veränderten sich die EPR-Spektren in einer für das Ketylradikalanion des Isocaprenoyl-CoA charakteristischen Weise

Evolution von Zwei-Komponenten-Systemen in Shewanella oneidensis MR-1. Die Histidinkinase ArcS und der Antwortregulator SO_4444,Zwei Komponenten, Zwei Modelle.

Die Eroberung neuer Lebensräume und die Anpassung an verschiedenste Umweltbedingungen können durch Organismen ein und derselben Familie erfolgen. Die entstehende Artenvielfalt resultiert primär nicht auf Grund von Veränderungen im genetischen Bauplan sondern vielmehr aus der Diversifikation der regulatorischen Signaltransduktionssysteme welche diesen Bauplan umsetzten. Unter diesen Systemen ist die Zwei-Komponenten-Signaltransduktion (TCS) von zentraler Bedeutung für die koordinierte Antwort auf umweltbedingte Veränderungen nicht nur in Bakterien sondern auch in Archaeen, Protisten und Pilzen. Prototypischerweise reagiert eine Rezeptorhistidinkinase auf ein extrazelluläres Signal und leitet dieses durch Transphosphorylierung auf einen zytoplasmatischen Antwortregulator weiter, welcher seinerseits als Transkriptionfaktor agiert. Dabei können orthologe Transkriptionsfaktoren für die Expression völlig unterschiedlicher Gene verantwortlich sein und es eröffnen sich Spielräume für die Anpassung an unterschiedlichste Umweltbedingungen. Shewanella Spezies sind Gram-negative, fakultativ anaerobe Alteromonaden. Die 48 bisher bekannten Arten haben nicht nur marine und limnische Habitate erobert, sondern man findet sie auch als Symbionten und Pathogene vor allem von Fischen. Die Besiedlung so unterschiedlicher ökologischer Nischen schlägt sich auch in der Diversität der Regulationssysteme nieder. So variieren allein die bekannten Zahlen von TCS-Proteinen innerhalb der Shewanellaceae von 67 in S. denitrificans OS217 bis 116 in S. sediminis HAW-EB3. Der Antwortregulator SO_4444 gehört dabei zu den TCS-Proteinen, die sich ausschließlich in einigen wenigen Shewanellen finden (S. baltica OS223 und S. oneidensis MR-1). Phylogenetische Untersuchungen des genetischen Kontextes von SO_4444 legen den Schluss nahe, dass der Antwortregulator zusammen mit einer Hybrid-Histidinkinase SO_4445 und weiteren fünf Genen durch lateralen Gentransfer aus Aermonas sp. aquiriert wurde. Deletionen und Insertionen in SO_4444 führen, verglichen mit dem Wildtyp, zu einer Beeinträchtigung der Biofilmbildung sowohl unter statischen Bedingungen als auch in einem hydrodynamischen Flusskammersystem. Eine Erhöhung des intrazellulären Levels an an zyklischem Guanosinmonophosphat (c-di-GMP) durch das Einbringen einer Guanylatzyklase aus Vibrio cholerae (VCA_0956) und die resultierende partielle Wiederherstellung des Wildtypphänotyps deuten auf eine Abhängigkeit des ∆SO_4444-Biofilmphänotyps von dem Signalmolekül. Darüber hinaus zeigen weitere Untersuchungen im genetischen Kontext von SO_4444 ebenso für die Hybrid-Histidinkinase SO_4445 einen deutlichen Einfluss auf den Biofilm. Interessanterweise unterscheidet sich dieser sowohl in Quantität und Morphologie. Zudem führt die Deletion beider Gene zu einem der Einzeldeletion ∆SO_4445 vergleichbaren Phänotyp. Damit lassen sowohl die differentiellen Phänotypen in ∆SO_4444 und ∆SO_4445, als auch das Verhalten des Doppel-Dletionsstamms keine offensichtlichen Schlüsse zu, ob oder wie die beiden Komponenten zusammenarbeiten. Jedoch zeigen unsere Untersuchungen deutlich, dass horizontaler Gentransfer von TCS-Elementen Einfluss auf ein bestehendes regulatorisches Netzwerk ausüben kann, und sich damit sowohl die Möglichkeit bietet das sensorische Potential eines Organismus zu erweitern als auch bestehende Regulationsmechanismen zu verfeinern oder neue zu etablieren. Im Gegensatz zu SO_4444 ist die Hybridsensorkinase ArcS (SO_0577) eine Autapomorphie aller Shewanellen und damit Bestandteil des Kernsatzes an TCS-Proteinen. Unsere Untersuchungen in S. oneidensis MR 1 konnten das Protein als korrespondierende Kinase zum Antwortregulator ArcA identifizieren. Die Anoxische Redoxkontrolle (Arc) regelt in Escherichia coli u.a. die Anpassung an einen wechselnden Sauerstoffgehalt in der Umwelt. Hierbei misst die Sensorkinase ArcB den Redox-Status des Chinon-Pools der Membran und leitet die Information über ein Phosphorelaissystem an ArcA weiter. Identifiziert man ein Pendant zum E. coli ArcA in Shewanella leicht durch eindeutige Sequenzähnlichkeiten (81% Sequenzidentität für S. oneidensis), so führt ein Abgleich von ArcB (E. coli) mit dem Shewanella Proteom zu keinem eindeutigen Ergebnis. Nur das Histidin-Phosphotransfer-Protein HptA zeigt signifikante Homologien zum C-Terminus von ArcB. Interessanterweise liegt hptA im gleichen genetischen Kontext wie das E. coli arcB. Diese Tatsache spricht entweder für Deletion oder Translokation des die Kinase kodierenden Genabschnitts. Phänotypische Vergleiche der Deletionstämme ΔarcS, ΔhptA und ΔarcA mit S. oneidensis Wildtyp offenbaren auffällige Übereinstimmungen der Mutanten bezogen auf Wachstum, Biofilmbildung und. Dabei zeigten zugehörige Doppel- und Tripple-Deletionen nie kumulative Effekte. Mehr noch in vitro Interaktionsstudien an aufgereinigten Proteinen zeigen Phosphotransfer zwischen ArcS, HptA und ArcA. Damit rekonstituiert sich das atypische Arc-der Shewanellaceae aus ArcS, HptA und ArcA. ArcS weicht in seiner modularen Struktur stark von der bekannter ArcB-Proteine ab und weist auch keinerlei signifikante Sequenzhomologien zu ArcB auf. Damit bildet ArcS einen phylogenetisch distinkten Arm von „ArcB“-Proteinen. Doch dieser auffälligen strukturellen und phylogenetischen Unterschiede zum Trotz ist es möglich, Deletionen in arcB (E. coli) und arcS und/oder hptA (S. oneidensis MR-1) zu kreuzkomplementieren. Zusammengefasst stützt dies die These einer Trunkierung der sensorischen Komponente ArcB und Rekrutierung der alternativen Sensorkinase ArcS als funktionalen Ersatz. Weiterführende in vitro und in vivo Untersuchungen an den katalytischen Resten ArcS-HKH731, ArcS-RecID1017 und ArcS-RecIID1162 deuten aber darauf hin, dass obwohl ArcS und ArcB funktional konvergieren, der Regulationsmechanismus fundamental unterscheidet. Vergleichende Analysen zwischen ArcB (E. coli)- und ArcS-Sensorik indizieren zudem eine Veränderung im Signalspektrum ebenso wie in der Signalaufnahme und Signalweiterleitung. Das Shewanella Arc-System steht damit ebenso beispielhaft wie der Antwortregulator SO_4444 für den evolutionären Wandel von TCS-Schaltkreisen, der es diesen Bakterien mit ermöglicht in verschiedenste Lebensräume vorzudringen und sich dort erfolgreich zu behaupten

Substratstereochemie und Untersuchungen zum Mechanismus der 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase aus Clostridium aminobutyricum

Die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase ist das Schlüsselenzym in der Fermentation von 4 Aminobutyrat zu Acetat, Ammoniak und Butyrat in Clostridium aminobutyricum. Darüber hinaus wurde die Dehydratase im 3-Hydroxypropionat/4-Hydroxybutyrat Zyklus in Metallosphaera sedula als Bindeglied des bisher unentdeckten fünften CO2-Fixierungsweges nachgewiesen. Dieses außer Clostridien nun auch in Archaeen entdeckte Enzym ist ein Homotetramer, in dem jede der 56 kDa Untereinheiten einen [4Fe-4S]-Cluster und einen FAD-Kofaktor enthält. Es katalysiert die ungewöhnlich reversible Dehydratisierung von 4-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA, die die Abstraktion des nicht aktivierten -Protons (pK ca. 40) von 4-Hydroxybutyryl-CoA erfordert. Der postulierte Mechanismus über ein Enoxyradikalintermediat, das zusammen mit Wasserstoffbrückenbindungen zum Thioestercarbonyl den pK auf 8 absenkt, wurde in EPR-Studien untersucht. Es wurde substratinduziert bisher eindeutig nur das Flavinsemichinonradikal sowie möglicherweise ein [4Fe-4S]+-Cluster-Signal, jedoch kein Substratradikal nachgewiesen. Die Aufklärung der Kristallstruktur offenbarte große strukturelle Ähnlichkeiten zu den Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenasen. Obwohl bisher kein Kokristall mit Substrat vorliegt, kann daraus ein Substratbindemodell abgeleitet werden. Wie aus der Kristallstruktur hervorgeht, sind die für die Katalyse in Frage kommenden Aminosäurereste His292, Glu455 und Glu257 sowie der FAD-Kofaktor und der [4Fe-4S]-Cluster im hypothetischen aktiven Zentrum lokalisiert. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Substratstereochemie und Untersuchung der Interaktion mit den Kofaktoren zur Bestätigung des Bindemodells. Dafür wurden stereoselektiv isotopenmarkierte 4-Hydroxy[2-2H1]butyryl-CoA-Ester ausgehend von 3 Benzyloxypropan-1-ol über chirale Reduktion mit ALPINE-BORANETM und anschließender Kettenverlängerung synthetisiert. Untersuchungen der Reaktionsprodukte mit MALDI-TOF-MS zeigten eine Abstraktion des 2Re-Protons. Zusammen mit der zuvor festgestellten Abstraktion des 3Si-Protons kann nun für die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratayse und die Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenase dieselbe Stereoselektivität bestätigt werden. Die ungewöhnliche Koordinierung mit His292 zeigt, dass das Fe1 des Clusters als Lewis-Säure bei der Abstraktion der Hydroxylgruppe des Substrats, analog zur Aconitase, wirken könnte. In der vorliegenden Arbeit konnte hierfür ein Indiz durch Mössbauerstudien erbracht werden. Weder ENDOR- noch EPR-Studien konnten bisher eine Cluster-Substratinteraktion oder die postulierten Substratradikalintermediate nachweisen. Untersuchungen mit UV-Vis-Spektroskopie des im oxidierten Zustand aktivsten Enzyms zeigen nach Zugabe verschiedener Substrate „charge-transfer“-Phänomene und einen unterschiedlich raschen Übergang zum Semichinonzustand. Die stereoselektive Synthese von 4-Hydroxy[4-3H,2H1]butyryl-CoA über 4-Oxo[4-2H1]butyrat ausgehend von Diethylformylsuccinat erlaubte die Untersuchung der Stereoselektivität der Eliminierung der Hydroxylgruppe. Die Analyse der Konfiguration der Methylgruppe des [4-3H,2H1]Crotonyl-CoA über chirale Essigsäure zeigte, dass die Wassereliminierung stereoselektiv mit Retention abläuft und bezüglich des -Protons als anti-Eliminierung beschrieben werden kann. Diese Resultate bestätigen somit das aus der Kristallstruktur abgeleitete Substratbindemodell

Mutationen im Hämagglutinin und dem NS1-Protein steigern die Virulenz hochpathogener aviärer Influenzaviren

Im Jahr 1999 kam es in Italien bei Geflügel zu einem Ausbruch hochpathogener aviärer Influenza A-Viren (HPAI-Viren) des Subtyps H7N1, der zum Verlust von 14 Millionen Tieren führte. Aus Stammbaumanalysen ging hervor, dass die HPAI-Viren aus bereits zuvor zirkulierenden Influenzaviren niedriger Pathogenität (LPAI-Viren) hervorgingen. Neben der Entwicklung einer multibasischen Spaltstelle im Hämagglutinin (HA) dieser Viren konnten durch Sequenzanalysen weitere markante Unterschiede zwischen HPAI- und LPAI-Viren detektiert werden. Das HA der HPAI-Viren wies eine zusätzliche Glykosylierung an Position 123 in der Nähe der Rezeptorbindungsstelle auf. Die meisten LPAI-Isolate besitzen dort kein oder nur ein Glykan an Position 149. Im NS1-Protein, welches den viralen Faktor für die Suppression der zellulären Immunantwort darstellt, konnten Mutationen im Kernexportsignal (NES) sowie eine Deletion von sechs Aminosäuren am C-Terminus der HPAI-Viren festgestellt werden. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurden daher rekombinante Viren des HPAI-Isolats A/ostrich/Italy/984/00 (984) generiert, die sich ausschließlich in den Glykosylierungstellen nahe der Rezeptorbindungstasche des HAs unterschieden. Das Vorhandensein eines Glykans an Position 123 stellte sich in den Experimenten als signifikante Pathogenitätsdeterminante heraus. Die zusätzliche N-Glykosylierung führte zu einer erhöhten Freisetzungsgeschwindigkeit der Viren am Ende des Replikationszyklus. Die dadurch beschleunigte systemische Virusausbreitung im aviären Wirt steigerte die Mortalität erheblich. Des Weiteren wurden für den zweiten Teil der Arbeit rekombinante 984 NS1-Mutanten hergestellt, deren NES und/oder C-Terminus von einem LPAI-Virusisolat stammen. Es konnte gezeigt werden, dass diese Viren reduziertes Wachstum auf aviären Zellen sowie eine verminderte Infektiosität für den aviären Wirt aufwiesen. Dieser Effekt konnte auf eine veränderte Lokalisation des HPAI-NS1 in den verschiedenen Stadien der Infektion zurückgeführt werden. Zusammengenommen bewirken das zusätzliche Glykan an Position 123 des HA und die Mutationen im NS1-Protein des HPAI-Virus eine deutliche Steigerung der Pathogenität im aviären Wirt

Evolution von Zwei-Komponenten-Systemen in Shewanella oneidensis MR-1. Die Histidinkinase ArcS und der Antwortregulator SO_4444,Zwei Komponenten, Zwei Modelle.

Die Eroberung neuer Lebensräume und die Anpassung an verschiedenste Umweltbedingungen können durch Organismen ein und derselben Familie erfolgen. Die entstehende Artenvielfalt resultiert primär nicht auf Grund von Veränderungen im genetischen Bauplan sondern vielmehr aus der Diversifikation der regulatorischen Signaltransduktionssysteme welche diesen Bauplan umsetzten. Unter diesen Systemen ist die Zwei-Komponenten-Signaltransduktion (TCS) von zentraler Bedeutung für die koordinierte Antwort auf umweltbedingte Veränderungen nicht nur in Bakterien sondern auch in Archaeen, Protisten und Pilzen. Prototypischerweise reagiert eine Rezeptorhistidinkinase auf ein extrazelluläres Signal und leitet dieses durch Transphosphorylierung auf einen zytoplasmatischen Antwortregulator weiter, welcher seinerseits als Transkriptionfaktor agiert. Dabei können orthologe Transkriptionsfaktoren für die Expression völlig unterschiedlicher Gene verantwortlich sein und es eröffnen sich Spielräume für die Anpassung an unterschiedlichste Umweltbedingungen. Shewanella Spezies sind Gram-negative, fakultativ anaerobe Alteromonaden. Die 48 bisher bekannten Arten haben nicht nur marine und limnische Habitate erobert, sondern man findet sie auch als Symbionten und Pathogene vor allem von Fischen. Die Besiedlung so unterschiedlicher ökologischer Nischen schlägt sich auch in der Diversität der Regulationssysteme nieder. So variieren allein die bekannten Zahlen von TCS-Proteinen innerhalb der Shewanellaceae von 67 in S. denitrificans OS217 bis 116 in S. sediminis HAW-EB3. Der Antwortregulator SO_4444 gehört dabei zu den TCS-Proteinen, die sich ausschließlich in einigen wenigen Shewanellen finden (S. baltica OS223 und S. oneidensis MR-1). Phylogenetische Untersuchungen des genetischen Kontextes von SO_4444 legen den Schluss nahe, dass der Antwortregulator zusammen mit einer Hybrid-Histidinkinase SO_4445 und weiteren fünf Genen durch lateralen Gentransfer aus Aermonas sp. aquiriert wurde. Deletionen und Insertionen in SO_4444 führen, verglichen mit dem Wildtyp, zu einer Beeinträchtigung der Biofilmbildung sowohl unter statischen Bedingungen als auch in einem hydrodynamischen Flusskammersystem. Eine Erhöhung des intrazellulären Levels an an zyklischem Guanosinmonophosphat (c-di-GMP) durch das Einbringen einer Guanylatzyklase aus Vibrio cholerae (VCA_0956) und die resultierende partielle Wiederherstellung des Wildtypphänotyps deuten auf eine Abhängigkeit des ∆SO_4444-Biofilmphänotyps von dem Signalmolekül. Darüber hinaus zeigen weitere Untersuchungen im genetischen Kontext von SO_4444 ebenso für die Hybrid-Histidinkinase SO_4445 einen deutlichen Einfluss auf den Biofilm. Interessanterweise unterscheidet sich dieser sowohl in Quantität und Morphologie. Zudem führt die Deletion beider Gene zu einem der Einzeldeletion ∆SO_4445 vergleichbaren Phänotyp. Damit lassen sowohl die differentiellen Phänotypen in ∆SO_4444 und ∆SO_4445, als auch das Verhalten des Doppel-Dletionsstamms keine offensichtlichen Schlüsse zu, ob oder wie die beiden Komponenten zusammenarbeiten. Jedoch zeigen unsere Untersuchungen deutlich, dass horizontaler Gentransfer von TCS-Elementen Einfluss auf ein bestehendes regulatorisches Netzwerk ausüben kann, und sich damit sowohl die Möglichkeit bietet das sensorische Potential eines Organismus zu erweitern als auch bestehende Regulationsmechanismen zu verfeinern oder neue zu etablieren. Im Gegensatz zu SO_4444 ist die Hybridsensorkinase ArcS (SO_0577) eine Autapomorphie aller Shewanellen und damit Bestandteil des Kernsatzes an TCS-Proteinen. Unsere Untersuchungen in S. oneidensis MR 1 konnten das Protein als korrespondierende Kinase zum Antwortregulator ArcA identifizieren. Die Anoxische Redoxkontrolle (Arc) regelt in Escherichia coli u.a. die Anpassung an einen wechselnden Sauerstoffgehalt in der Umwelt. Hierbei misst die Sensorkinase ArcB den Redox-Status des Chinon-Pools der Membran und leitet die Information über ein Phosphorelaissystem an ArcA weiter. Identifiziert man ein Pendant zum E. coli ArcA in Shewanella leicht durch eindeutige Sequenzähnlichkeiten (81% Sequenzidentität für S. oneidensis), so führt ein Abgleich von ArcB (E. coli) mit dem Shewanella Proteom zu keinem eindeutigen Ergebnis. Nur das Histidin-Phosphotransfer-Protein HptA zeigt signifikante Homologien zum C-Terminus von ArcB. Interessanterweise liegt hptA im gleichen genetischen Kontext wie das E. coli arcB. Diese Tatsache spricht entweder für Deletion oder Translokation des die Kinase kodierenden Genabschnitts. Phänotypische Vergleiche der Deletionstämme ΔarcS, ΔhptA und ΔarcA mit S. oneidensis Wildtyp offenbaren auffällige Übereinstimmungen der Mutanten bezogen auf Wachstum, Biofilmbildung und. Dabei zeigten zugehörige Doppel- und Tripple-Deletionen nie kumulative Effekte. Mehr noch in vitro Interaktionsstudien an aufgereinigten Proteinen zeigen Phosphotransfer zwischen ArcS, HptA und ArcA. Damit rekonstituiert sich das atypische Arc-der Shewanellaceae aus ArcS, HptA und ArcA. ArcS weicht in seiner modularen Struktur stark von der bekannter ArcB-Proteine ab und weist auch keinerlei signifikante Sequenzhomologien zu ArcB auf. Damit bildet ArcS einen phylogenetisch distinkten Arm von „ArcB“-Proteinen. Doch dieser auffälligen strukturellen und phylogenetischen Unterschiede zum Trotz ist es möglich, Deletionen in arcB (E. coli) und arcS und/oder hptA (S. oneidensis MR-1) zu kreuzkomplementieren. Zusammengefasst stützt dies die These einer Trunkierung der sensorischen Komponente ArcB und Rekrutierung der alternativen Sensorkinase ArcS als funktionalen Ersatz. Weiterführende in vitro und in vivo Untersuchungen an den katalytischen Resten ArcS-HKH731, ArcS-RecID1017 und ArcS-RecIID1162 deuten aber darauf hin, dass obwohl ArcS und ArcB funktional konvergieren, der Regulationsmechanismus fundamental unterscheidet. Vergleichende Analysen zwischen ArcB (E. coli)- und ArcS-Sensorik indizieren zudem eine Veränderung im Signalspektrum ebenso wie in der Signalaufnahme und Signalweiterleitung. Das Shewanella Arc-System steht damit ebenso beispielhaft wie der Antwortregulator SO_4444 für den evolutionären Wandel von TCS-Schaltkreisen, der es diesen Bakterien mit ermöglicht in verschiedenste Lebensräume vorzudringen und sich dort erfolgreich zu behaupten

Der Toll-like-Rezeptor-4-Signalweg bei Cystischer Fibrose

Mutationen des Gens für den Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), ein cAMP-regulierten Chlorid-Kanal in der apikalen Membran von Epithelzellen sekretorischer Organe, führen zur klinischen Manifestation der letal verlaufenden Erbkrankheit Cystische Fibrose (CF). Diese ist gekennzeichnet durch eine frühe von Neutrophilen dominierte chronische Entzündung der Lunge mit letztlich permanenter bakterieller Besiedlung, vor allem mit Pseudomonas aeruginosa. Dabei lassen die Mutation und der Funktionsverlust des CFTR eine intrinsisch dysregulierte Immunantwort bei CF vermuten. In vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Expression von Komponenten der angeborenen Immunabwehr, wie Toll-like Rezeptoren (TLRs) und proinflammatorische Zytokine, liefern widersprüchliche oder nicht aussagekräftige Ergebnisse. Somit ist weiterhin unklar, ob Immunreaktionen bei CF beeinträchtigt oder bereits frühzeitig übermäßig stark aktiviert sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte in einem Zellkulturmodell der bronchialen CF-Epithelzelllinie CFBE und der CFTR-korrigierten Kontrolle gezeigt werden, dass die durch Signaltransduktion über TLR-4 vermittelte Immunreaktion nach Stimulation mit dem Gram-negativen Bakterium P. aeruginosa und dem bakteriellen Zellwandbestandteil LPS bei CF-Zellen beeinträchtigt war. Die CFTR-korrigierten Zellen waren in der Lage, durch dreifache Steigerung der Sekretion von IL-8, IL-6 und IP-10 stärker auf Stimuli von P. aeruginosa zu reagieren als CF-Zellen. Die Ursache der geschwächten Reaktionsfähigkeit bei CF lag in der verringerten Oberflächenexpression von TLR-4, die in einer reduzierten Bindung bakterieller Komponenten und damit in einer verminderten Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB resultierte. Die verringerte Oberflächenexpression von TLR-4 ging allerdings nicht mit einer reduzierten mRNA-Expression einher. Vielmehr lagen der Rezeptor oder seine Vorstufen bei CF-Zellen vermehrt intrazellulär vor. Dies ist vermutlich auf Veränderungen im Zusammenhang mit dem Funktionsverlust des CFTR zurückzuführen. Hierbei kommt es zu einem erhöhten intrazellulären pH-Wert, der die Aktivität und Effektivität posttranslationaler Modifikationen wie die Glykosylierung von Membranproteinen beeinträchtigt. Das verringerte Vorliegen von maturem TLR-4 oder erforderlichen Co-Rezeptoren könnte einen reduzierten Einbau in die Zellmembran bedeuten. Zusammenfassend unterstützen die vorliegenden Ergebnisse die Ansicht eines durch den Funktionsverlust des CFTR verursachten Krankheitsbildes bei CF. Die Veränderungen des TLR-4-Signalwegs könnten eine effektive Pathogenabwehr durch sowohl angeborene als auch adaptive Immunität nachhaltig beeinflussen und auf diese Weise eine frühzeitige Infektion und bakterielle Besiedlung der CF-Lunge begünstigen

(R)-Indolelactyl-CoA dehydratase, the key enzyme of tryptophan reduction to indolepropionate in Clostridium sporogenes

In this thesis the pathway of the fermentation from tryptophan to indolepropionate in Clostridium sporogenes and the key enzyme indolelactyl-CoA dehydratase were investigated. The intermediates and the end product were detected via mass spectrometry. Tryptophan disproportionates oxidatively via 3-indolepyruvate to 3-indoleacetate and reductively via (R)-3-indolelactate and (E)-3-indoleacrylate to 3-indolepropionate (IPA). IPA, which is formed in the human intestine, is transferred via the blood to the brain. In the human brain IPA scavenges reactive oxygen species (ROS) and thus protects from Alzheimer’s disease. The activities of the enzymes from the reductive branch of tryptophan fermentation (tryptophan transaminase, indolelactate dehydrogenase, indolelactate dehydratase and indoleacrylate reductase) were determined in the cell-free extract. Similarly, phenylalaine is reduced by C. sprogenes via (R)-phenyllactate and (E)-cinnamate to 3-phenylpropionate. Further this thesis focused on the key enzyme indolelactyl-CoA dehydratase, which catalyzes a very unusual syn-elimination of a non-activated proton at the β-position and an OH-group at the α-position of the thioester carbonyl by employing radical intermediates. Surprisingly the dehydratase purified from cultures growing on tryptophan shows a higher specific activity with indolelactyl-CoA than with phenyllactyl-CoA. The reverse was the case with the dehydratase purified from cultures growing on phenylalanine. Both native dehydratases consist of three subunits, which were identified via peptide MALDI-TOF fingerprinting and Nano LC-MS as the CoA-transferase (FldA) and the heterodimeric dehdratase (FldBC). The peptide sequences of the three subunits from the culture growing on tryptophan as well as that on phenylalanine are identical and derived from the same genes fldABC. The recombinant FldBC produced in E. coli shows even a higher specific activity than the native dehydratase FldABC. It has been observed that the molecular mass of the subunit FldB of the native dehydratase is around 2 kDa smaller than that calculated from the gene. Peptide fingerprinting showed that the N- and C-termini remained, but one internal 4.3 kDa peptide could not be detected. The predicted model of FldBC based on the structure of 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase shows that the C-terminal half of this peptide could have been cut off by posttranslational splicing. Probably tryptophan and phenylalanine induce slightly different splicing positions, which result in different specific activities of the dehydratase

Der Toll-like-Rezeptor-4-Signalweg bei Cystischer Fibrose

Mutationen des Gens für den Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), ein cAMP-regulierten Chlorid-Kanal in der apikalen Membran von Epithelzellen sekretorischer Organe, führen zur klinischen Manifestation der letal verlaufenden Erbkrankheit Cystische Fibrose (CF). Diese ist gekennzeichnet durch eine frühe von Neutrophilen dominierte chronische Entzündung der Lunge mit letztlich permanenter bakterieller Besiedlung, vor allem mit Pseudomonas aeruginosa. Dabei lassen die Mutation und der Funktionsverlust des CFTR eine intrinsisch dysregulierte Immunantwort bei CF vermuten. In vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Expression von Komponenten der angeborenen Immunabwehr, wie Toll-like Rezeptoren (TLRs) und proinflammatorische Zytokine, liefern widersprüchliche oder nicht aussagekräftige Ergebnisse. Somit ist weiterhin unklar, ob Immunreaktionen bei CF beeinträchtigt oder bereits frühzeitig übermäßig stark aktiviert sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte in einem Zellkulturmodell der bronchialen CF-Epithelzelllinie CFBE und der CFTR-korrigierten Kontrolle gezeigt werden, dass die durch Signaltransduktion über TLR-4 vermittelte Immunreaktion nach Stimulation mit dem Gram-negativen Bakterium P. aeruginosa und dem bakteriellen Zellwandbestandteil LPS bei CF-Zellen beeinträchtigt war. Die CFTR-korrigierten Zellen waren in der Lage, durch dreifache Steigerung der Sekretion von IL-8, IL-6 und IP-10 stärker auf Stimuli von P. aeruginosa zu reagieren als CF-Zellen. Die Ursache der geschwächten Reaktionsfähigkeit bei CF lag in der verringerten Oberflächenexpression von TLR-4, die in einer reduzierten Bindung bakterieller Komponenten und damit in einer verminderten Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB resultierte. Die verringerte Oberflächenexpression von TLR-4 ging allerdings nicht mit einer reduzierten mRNA-Expression einher. Vielmehr lagen der Rezeptor oder seine Vorstufen bei CF-Zellen vermehrt intrazellulär vor. Dies ist vermutlich auf Veränderungen im Zusammenhang mit dem Funktionsverlust des CFTR zurückzuführen. Hierbei kommt es zu einem erhöhten intrazellulären pH-Wert, der die Aktivität und Effektivität posttranslationaler Modifikationen wie die Glykosylierung von Membranproteinen beeinträchtigt. Das verringerte Vorliegen von maturem TLR-4 oder erforderlichen Co-Rezeptoren könnte einen reduzierten Einbau in die Zellmembran bedeuten. Zusammenfassend unterstützen die vorliegenden Ergebnisse die Ansicht eines durch den Funktionsverlust des CFTR verursachten Krankheitsbildes bei CF. Die Veränderungen des TLR-4-Signalwegs könnten eine effektive Pathogenabwehr durch sowohl angeborene als auch adaptive Immunität nachhaltig beeinflussen und auf diese Weise eine frühzeitige Infektion und bakterielle Besiedlung der CF-Lunge begünstigen

Production of glutaconic acid in recombinant Escherichia coli

Glutaric and glutaconic acids serve as monomers for the production of polymers. Glutaric acid (pentanedioic acid) might be used for polyester synthesis, related to the biodegradable Ecoflex available from BASF. Glutaconic acid (pentenedioic acid) could be applied for the formation of polyamides by polymerization with diamines. Furthermore this α,β-unsaturated dicarboxylic acid is suitable for radical polymerization. Therefore we became interested in the biological production of these dicarboxylic acids. The ideal material for biotechnological production of glutaconic acid would be glutamic acid, obtained by sugar fermentation. The chemical deamination of this α-amino acid to glutaconate is not executable. In contrary to this, strictly anaerobic bacteria, as are Acidaminococcus fermentans and Clostridium symbiosum can easily ferment glutamate to ammonia, acetate, butyrate, CO2 and H2 via 2-oxoglutarate, (R)-2-hydroxyglutarate, (R)-2-hydroxyglutaryl-CoA, and glutaconyl-CoA. Inhibition of the subsequent decarboxylation to crotonyl-CoA would lead to glutaconate. We achieved this aim on another route, the conversion of Escherichia coli into a glutaconate producer by introducing six genes encoding (R)-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (HgdH), glutaconate CoA-transferase (GctAB), and the extremely oxygen sensitive activator of the dehydratase (HgdC) from A. fermentans as well as the also oxygen sensitive (R)-2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase (HgdAB) from C. symbiosum. Hence, within 5 h after induction of gene expression the recombinant E. coli produced 2.7 ± 0.2 mM glutaconate on a medium containing 1.5% peptone, 0.3 % yeast extract, 100 mM NaCl, 5 mM glucose, 3 mM cysteine, 10 mM glutamate, 2 mM ferric citrate, 0.2 mM riboflavin, and antibiotics. Interestingly, initially the concentration of glutamate decreased by 30% but later regained its original level, whereas glucose was almost quantitatively converted to two ethanol. The reduction of glutaconyl-CoA to glutaryl-CoA is catalyzed by an enzyme involved in the synthesis of cyclohexanecarboxylate and benzoate in Syntrophus aciditrophicus. Preliminary experiments indicate that coexpression of the genes encoding glutaryl-CoA dehydrogenase and electron-transferring flavoprotein (EtfAB) from S. aciditrophicus in E. coli yield an enzyme system that together with hydrogenase catalyzes the bifurcation of 2 NAD(P)H to glutaconyl-CoA and ferredoxin. Thus glutaryl-CoA and H2 were formed though at a very low rate