Amperometric cytochrome c3-based biosensor for chromate determination

International audienceThe chromate reductase activity of cytochrome c3 (Cyt c3, Mr 13 000), isolated from the sulfate-reducing bacterium Desulfomicrobium norvegicum, was used to develop an amperometric biosensor to measure chromate (CrO42−) bioavailability. The performance of various biosensor configurations for qualitative and quantitative determination of Cr(VI) was studied. Biosensor properties depend on the technique used to immobilize the enzyme on the electrode (glassy carbon electrode). Immobilization of Cyt c3 by entrapment in poly 3,4-ethylenedioxythiophene films denatured the enzyme, while application of an adsorption technique did not affect enzyme activity but the detection range was limited. The best results were obtained with dialysis membranes, which allowed the determination of Cr(VI) from 0.20 to 6.84 mg l−1 (3.85–132 μM) with a sensitivity of 35 nA mg−1 l (1.82 nA μM−1). No interference was observed with As(V), As(III) and Fe(III). Only a small amount of Cyt c3 (372 ng of protein) was needed for this biosensor

Development of an enzymatic amperometric biosensor using cytochromes C3 for the fast quantification of chromate bio-availability in the environment.

International audienceThe presence of toxic Heavy Metals and Metalloids (HMM) in the environment greatly affects the quality of water, soil and chain-food. The toxicity of the HMM depends on metal availability. Many analytical methods, such as sequential extraction or mathematical modelling, have been used for a long time for the assessment of HMM bioavailability. However, these techniques are very often difficult, expensive and long. The biosensors, like analytical tools, have advantages while bringing in addition to specificity, fast and quantitative measurement of a metal that reacts with the biomaterial. This principle is applied to detect the presence of bio-available concentrations of certain metals. The biosensor presented in this study is an amperometric one and its sensitive part is a hemo-protein, the cytochrome c3 from Desulfomicrobium norvegicum. The cytochrome c3 has been chosen for its better properties as a reducing agent of chromate (CrO42-). This study required instrumental developments or adaptations: the development of glassy carbon electrode with immobilized cytochrome c3 and the implementation of electrochemical methods for the study of redox systems, i.e. cyclic voltammetry (CV) and chronoamperometry (CA). The performances of various configurations of biosensors, according to the mode of immobilization of the enzyme, are studied for the qualitative and quantitative determination of chromate. These tools made it possible to identify and follow the redox reactions taking place during the contact of the electrode without and with chromate in solution. The tests on the various configurations of electrode allowed us, for the moment, to choose two promising configurations: The first one is an immobilization of the enzyme with a dialysis membrane and the second is an immobilization with a cellulose nitrate filter. Chromate concentrations from 0.2 to 6.8 mg/L can be detected by the biosensors that were designed

Bioremediation of polluted soils and effluents using sulfate-reducing bacteria : Molecular mechanisms of the metal resistanc

International audienc

Bioremédiation du chrome et de l'arsenic par les bactéries sulfato-réductrices (effets sur le métabolisme)

La bioremédiation est une solution alternative aux techniques existantes pour la décontamination d'effluents pollués par les métaux lourds. Les bactéries sulfato-réductrices réduisent de nombreux métaux lourds et modifient leurs propriétés physico-chimiques, facilitant leur élimination. Nous avons comparé par microcalorimétrie isotherme la tolérance de deux BSR, "Desulfovibrio vulgaris" Hildenborough et "Desulfomicrobium norvegicum", vis à vis du chrome et de l'arsenic. Un découpage entre production d'énergie et croissance de deux souches a été mis en évidence en présence de Cr (VI), ainsi qu'une accélération de la croissance de "De. Norvegicum" en présence de faibles concentrations de As (V). "De. norvegicum" apparaît plus tolérante à Cr(VI) que DvH. Les états d'oxydation des métaux ont été suivis par HPLC - ICMS. Par sa tolérance et sa précipitation de Cr (VI) et As(V), "De. norvegicum" apparaît comme très intéressante pour la décontamination biologique d'effluents pollués par les métaux lourds.AIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF

Bioremédiation du chrome par les bactéries sulfato-réductrices

La mise au point de procédés mettant en oeuvre des micro-organismes peut être un moyen efficace et écologique pour décontaminer de milieux pollués par des métaux lourds (bioremédiation). Les bactéries sulfato-réductrices (BSR) sont de bonnes candidates pour ce type d'applications : ces bactéries anaérobies peuvent réduire des métaux tels que le Cr (VI) en Cr(III) moins toxique et insoluble, ce qui permet de l'extraire d'un effluent ou de l'immobiliser dans un sol. La réduction des métaux par les BSR est chimique (via l'H2S produit par le métabolisme) et enzymatique (via des métalloprotéines). Le but de ce travail a été de caractériser la réduction enzymatique du Cr(VI) par les BSR à un niveau cellulaire et moléculaire. Une meilleure compréhension de ce processus est indispensable pour optimiser la capacité de bioremédiation des BSR dans des bioprocédés, et pour sélectionner des enzymes pour la conception des réacteurs à enzymes ou de biocapteurs. Nous avons comparé différentes souches de BSR pour la réduction enzymatique du Cr (VI), et sélectionné "Desulfomicrobium norvegicum". Cette souche peut croître en présence de 500 [mu]M Cr (VI), même si à cette concentration le chromate induit un stress (augmentation de la phase de latence, allongement des cellules,...), et a ainsi été choisie pour des essais en bioréacteurs par la COGEMA et le BRGM. L'activité Cr(VI)-réductase a été comparée chez différents cytochromes c3 (cytochromes polyhémiques ayant des hèmes de potentiels redox négatifs) et chez des mutants obtenus par mutagénèse dirigée. Les résultats suggèrent le rôle d'un potentiel d'oxydo-réduction très électronégatif dans l'activité métal-réductase. Nos résultats ont montré pour la première fois une activité métal-réductase chez les hydrogénases ) [Fe] et à [Ni-Fer], partenaires physiologiques des cytochromes c3. L'interaction Cr(VI)/cytochrome c3 a été étudiée par RMN, RPE et électrochimie. Les résultats obtenus ont permis (i) de déterminer le site de fixation du Cr(VI) et la stoechiométrie de la réaction, et (ii) de proposer un modèle de transfert d'électrons entre le cytochrome et le Cr (VI). Ainsi, Cr(VI) se fixe sur des lysines situées près de l'hème IV du cytochrome, et reçoit les électrons nécessaires à sa réduction via l'hème IV grâce à un transfert intramoléculaire d'électrons des hèmes I et III vers l'hème IV.AIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF