Untersuchungen zur generellen Stressantwort von Bacillus subtilis nach Einwirkung von Umweltstress und bei niedriger Temperatur

Zusammenfassung Der alternative Sigmafaktor SigB kontrolliert die Expression des generellen Stressregulons in Bacillus subtilis. Durch die Synthese von generellen Stressproteinen werden nicht-wachsende B. subtilis-Zellen mit einer unspezifischen, vielfältigen und vorsorgenden Resistenz gegen zukünftigen Stress ausgestattet. Um die Funktion der generellen Stressantwort im Adaptationsnetzwerk dieses Gram-positiven Modellorganismus besser zu verstehen, wurden die Veränderungen im Transkriptom nach Einwirkung von Hitze, Salz und Ethanolstress analysiert. Diese Studie wurde mit DNA-Makroarrays durchgeführt, auf die PCR-Produkte aller 4107 Gene gespottet waren. Insgesamt konnten 124 SigB-abhängige Gene identifiziert werden. Darunter wurden 62 Gene neu dem SigB-Regulon zugeordnet und 62 schon zuvor beschriebene SigB-abhängige Gene bestätigt. Die genomweite Betrachtung des Transkriptionsprofils nach Umweltstress erlaubte auch eine Analyse der spezifischen Stressantworten von B. subtilis auf Hitze-, Salz- und Ethanolstress. Neu war die Induktion des ECF-Sigmafaktors SigW und seines Regulons nach 4% Salzstress. In ?dot blot?-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Induktion des SigW-Regulons osmotisch bedingt war. Außerdem wurde die Induktion der generellen Stressantwort bei niedriger Temperatur untersucht. Mit SigB-abhängigen LacZ- und GFP-Reporterfusionen konnte der Induktionsverlauf des SigB-Regulons in der Kälte beobachtet werden. Bei 37 °C wird das SigB-Regulon nach Umweltstress sofort, aber transient induziert. In der Kälte war dagegen eine langanhaltende Induktion der ctc::lacZ-Reporterfusion in der exponentiellen Phase zu sehen. Nach einem Maximum in der exponentiellen Wachstumsphase fiel die Induktion bis zum Übergang in die stationäre Phase langsam wieder ab, um dann auf einem erhöhten Level zu stagnieren. Die Analyse verschiedener Regulatormutanten der SigB-Aktivität bestätigte den temperatursensitiven Phänotyp einer sigB-Mutante und dokumentierte die Wachstumsdefekte einer rsbP-Mutante und einer rsbUP-Mutante bei 15 °C, die vermutlich durch die schwache Induktion des SigB-Regulons in diesen Zellen verursacht waren. So stellte eine zusätzliche Deletion des Gens für den Anti-Antisigmafaktor RsbV in der rsbUP-Mutante die volle Induktion der Reporterfusion wieder her, wodurch ebenfalls der Wachstumsdefekt aufgehoben wurde. Die intensive, langanhaltende Induktion des generellen Stressregulons in der rsbUPV-Tripelmutante unterstützt die These eines neuen Signaltransduktionsweges zur Aktivierung von SigB in der Kälte. In weiteren Arbeiten wird zu klären sein, ob in die Aktivierung von SigB in der Kälte weitere Proteine einbezogen sind oder für die Aktivierung eine intrinsische Instabilität des RsbW/SigB-Komplexes verantwortlich ist

Untersuchungen zur generellen Stressantwort von Bacillus subtilis nach Einwirkung von Umweltstress und bei niedriger Temperatur

Zusammenfassung Der alternative Sigmafaktor SigB kontrolliert die Expression des generellen Stressregulons in Bacillus subtilis. Durch die Synthese von generellen Stressproteinen werden nicht-wachsende B. subtilis-Zellen mit einer unspezifischen, vielfältigen und vorsorgenden Resistenz gegen zukünftigen Stress ausgestattet. Um die Funktion der generellen Stressantwort im Adaptationsnetzwerk dieses Gram-positiven Modellorganismus besser zu verstehen, wurden die Veränderungen im Transkriptom nach Einwirkung von Hitze, Salz und Ethanolstress analysiert. Diese Studie wurde mit DNA-Makroarrays durchgeführt, auf die PCR-Produkte aller 4107 Gene gespottet waren. Insgesamt konnten 124 SigB-abhängige Gene identifiziert werden. Darunter wurden 62 Gene neu dem SigB-Regulon zugeordnet und 62 schon zuvor beschriebene SigB-abhängige Gene bestätigt. Die genomweite Betrachtung des Transkriptionsprofils nach Umweltstress erlaubte auch eine Analyse der spezifischen Stressantworten von B. subtilis auf Hitze-, Salz- und Ethanolstress. Neu war die Induktion des ECF-Sigmafaktors SigW und seines Regulons nach 4% Salzstress. In ?dot blot?-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Induktion des SigW-Regulons osmotisch bedingt war. Außerdem wurde die Induktion der generellen Stressantwort bei niedriger Temperatur untersucht. Mit SigB-abhängigen LacZ- und GFP-Reporterfusionen konnte der Induktionsverlauf des SigB-Regulons in der Kälte beobachtet werden. Bei 37 °C wird das SigB-Regulon nach Umweltstress sofort, aber transient induziert. In der Kälte war dagegen eine langanhaltende Induktion der ctc::lacZ-Reporterfusion in der exponentiellen Phase zu sehen. Nach einem Maximum in der exponentiellen Wachstumsphase fiel die Induktion bis zum Übergang in die stationäre Phase langsam wieder ab, um dann auf einem erhöhten Level zu stagnieren. Die Analyse verschiedener Regulatormutanten der SigB-Aktivität bestätigte den temperatursensitiven Phänotyp einer sigB-Mutante und dokumentierte die Wachstumsdefekte einer rsbP-Mutante und einer rsbUP-Mutante bei 15 °C, die vermutlich durch die schwache Induktion des SigB-Regulons in diesen Zellen verursacht waren. So stellte eine zusätzliche Deletion des Gens für den Anti-Antisigmafaktor RsbV in der rsbUP-Mutante die volle Induktion der Reporterfusion wieder her, wodurch ebenfalls der Wachstumsdefekt aufgehoben wurde. Die intensive, langanhaltende Induktion des generellen Stressregulons in der rsbUPV-Tripelmutante unterstützt die These eines neuen Signaltransduktionsweges zur Aktivierung von SigB in der Kälte. In weiteren Arbeiten wird zu klären sein, ob in die Aktivierung von SigB in der Kälte weitere Proteine einbezogen sind oder für die Aktivierung eine intrinsische Instabilität des RsbW/SigB-Komplexes verantwortlich ist

Chill Induction of the SigB-Dependent General Stress Response in Bacillus subtilis and Its Contribution to Low-Temperature Adaptation

A variety of environmental and metabolic cues trigger the transient activation of the alternative transcription factor SigB of Bacillus subtilis, which subsequently leads to the induction of more than 150 general stress genes. This general stress regulon provides nongrowing and nonsporulated cells with a multiple, nonspecific, and preemptive stress resistance. By a proteome approach we have detected the expression of the SigB regulon during continuous growth at low temperature (15°C). Using a combination of Western blot analysis and SigB-dependent reporter gene fusions, we provide evidence for high-level and persistent induction of the sigB operon and the SigB regulon, respectively, in cells continuously exposed to low temperatures. In contrast to all SigB-activating stimuli described thus far, induction by low temperatures does not depend on the positive regulatory protein RsbV or its regulatory phosphatases RsbU and RsbP, indicating the presence of an entirely new pathway for the activation of SigB by chill stress in B. subtilis. The physiological importance of the induction of the general stress response for the adaptation of B. subtilis to low temperatures is emphasized by the observation that growth of a sigB mutant is drastically impaired at 15°C. Inclusion of the compatible solute glycine betaine in the growth medium not only improved the growth of the wild-type strain but rescued the growth defect of the sigB mutant, indicating that the induction of the general stress regulon and the accumulation of glycine betaine are independent means by which B. subtilis cells cope with chill stress

RsbV-Independent Induction of the SigB-Dependent General Stress Regulon of Bacillus subtilis during Growth at High Temperature

General stress proteins protect Bacillus subtilis cells against a variety of environmental insults. This adaptive response is particularly important for nongrowing cells, to which it confers a multiple, nonspecific, and preemptive stress resistance. Induction of the general stress response relies on the alternative transcription factor, SigB, whose activity is controlled by a partner switching mechanism that also involves the anti-sigma factor, RsbW, and the antagonist protein, RsbV. Recently, the SigB regulon has been shown to be continuously induced and functionally important in cells actively growing at low temperature. With the exception of this chill induction, all SigB-activating stimuli identified so far trigger a transient expression of the SigB regulon that depends on RsbV. Through a proteome analysis and Northern blot and gene fusion experiments, we now show that the SigB regulon is continuously induced in cells growing actively at 51°C, close to the upper growth limit of B. subtilis. This heat induction of SigB-dependent genes requires the environmental stress-responsive phosphatase RsbU, but not the metabolic stress-responsive phosphatase RsbP. RsbU dependence of SigB activation by heat is overcome in mutants that lack RsbV. In addition, loss of RsbV alone or in combination with RsbU triggers a hyperactivation of the general stress regulon exclusively at high temperatures detrimental for cell growth. These new facets of heat induction of the SigB regulon indicate that the current view of the complex genetic and biochemical regulation of SigB activity is still incomplete and that SigB perceives signals independent of the RsbV-mediated signal transduction pathways under heat stress conditions

Proteomics as a tool for assessment of therapeutics in transfusion medicine: Evaluation of prothrombin complex concentrates

BACKGROUND: Proteomic technologies are evolving tools to analyze complex protein patterns that to date have been rarely applied to transfusion medicine. The analysis of prothrombin complex concentrates (PCCs) was used as a model to evaluate to what extent these technologies can detect differences in blood-derived therapeutics beyond that of standard quality control. STUDY DESIGN AND METHODS: Three PCCs (two batches each) were individually analyzed for differences in protein content by functional assays, two-dimensional gel electrophoresis, and mass spectrometry. The results were compared to a pool of 72 normal plasma samples. RESULTS: A highly complex protein pattern was found that varied considerably among the three PCCs: 192 spots comprising 40 different proteins were identified. Factor (F) IX activities of the three PCCs were comparable, but their F IX protein contents differed considerably. Many proteins were present in multiple spots (e.g. FII, FX, protein C, vitronectin), indicating a high degree of posttranslational modifications. In comparison with untreated pooled plasma, PCCs displayed several low-molecular-weight variants of proteins that likely constitute potential degradation products. CONCLUSION: Proteomic technologies allow the identification of potentially modified proteins in clotting factor concentrates, indicating that they could become a useful tool for transfusion medicine to assess the impact of processing on the integrity of blood-derived therapeutics

Functional and structural characterization of RsbU, a stress signaling protein phosphatase 2C

RsbU is a positive regulator of the activity of σ, the general stress-response σ factor of Gram microorganisms. The N-terminal domain of this protein has no significant sequence homology with proteins of known function, whereas the C-terminal domain is similar to the catalytic domains of PP2C-type phosphatases. The phosphatase activity of RsbU is stimulated greatly during the response to stress by associating with a kinase, RsbT. This association leads to the induction of σ activity. Here we present data on the activation process and demonstrate in vivo that truncations in the N-terminal region of RsbU are deleterious for the activation of RsbU. This conclusion is supported by comparisons of the phosphatase activities of full-length and a truncated form of RsbU in vitro. Our determination of the crystal structure of the N-terminal domain of RsbU from Bacillus subtilis reveals structural similarities to the regulatory domains from ubiquitous protein phosphatases and a conserved domain of σ-factors, illuminating the activation processes of phosphatases and the evolution of "partner switching." Finally, the molecular basis of kinase recruitment by the RsbU phosphatase is discussed by comparing RsbU sequences from bacteria that either possess or lack RsbT

Profiling of alterations in platelet proteins during storage of platelet concentrates

BACKGROUND: The quality of platelet concentrates (PCs) is primarily determined in vitro by selective methods (e.g., pH, aggregometry), which provide only limited information on certain platelet (PLT) characteristics. In contrast, proteomic technologies provide a comprehensive overview of the PLT proteome. High interassay variability, however, limits meaningful assessment of samples taken from the same product over time or before and after processing. STUDY DESIGN AND METHODS: Differential in-gel electrophoresis (DIGE) and mass spectrometry were applied to analyze changes in the PLT proteome during storage of PCs. RESULTS: DIGE provides a comprehensive and reproducible overview of the cytoplasmic PLT proteome (median standard deviation of protein spot intensities, 5%-9%). Although 97 percent of cytosolic PLT proteins remained unchanged over a 9-day storage period, septin 2 showed characteristic alterations that preceded by several days more widespread alterations affecting numerous other proteins. Also beta-actin and gelsolin are potential marker proteins for changes in the PLT proteome. Interestingly septin 2 and gelsolin are affected during apoptosis, indicating that apoptosis in PCs may have an impact on PLT storage. CONCLUSION: DIGE is a tool for comprehensively assessing the impact of storage on the global proteome profile of therapeutic PCs. Most of the changes detected are in high-abundance PLT proteins