CoA Synthase influences adherence-independent growth and survival of mammalian cells in vitro

Aims. We aimed to study the influence of the expression level, activity and subcellular localization of CoA Synthase (CoASy) on anchoring independent growth and viability of in vitro cultured cells. Methods. Abilities of cells to form colonies in semisolid agarose and survive in growth factor depleted conditions were tested. A panel of HEK293 stable cell lines which over express wild type, catalytically inactive or mitochondria association mutants of CoASy were used in the study. Effects of CoASy down regulation by siRNA on malignant phenotype of HepG2 cells have been studied. Results. We report here that changes in CoASy expression level affect anchoring independent growth and viability of mammalian cells. Catalytic activity of CoASy and its association with mitochondria are crucial for mediating of the observed effects. Conclusions. Presented data indicate CoASy has positive impact on activity of signalling pathways in the cell and reveal unknown before functional link between signal transduction and metabolism.Мета. Оцінити вплив рівня експресії, каталітичної активності та субклітинної локалізації КоА синтази на незалежний від контактів із позаклітинним матриксом ріст та виживання клітин у культурі in vitro. Методи. Вивчали здатність клітин до формування колоній в напіврідкій агарозі та виживання за відсутності ростових факторів. Створено стабільні клітинні лінії на основі клітин HEK293, що надекспресують КоА синтазу дикого типу, а також мутантні – каталітично неактивну форму, або КоА синтазу із делетованою послідовністю, що відповідає за асоціацію з мітохондріями. Досліджували також ефекти опосередкованого міРНК зниження ендогенного рівня КоА синтази на раковий фенотип клітин HepG2. Результати. Зміни в експресії КоА синтази впливають на незалежний від прикріплення ріст і виживання клітин ссавців. Каталітична активність КоА синтази, а також асоціація її з мітохондріями виявилися необхідними для опосередкування спостережених ефектів. Висновки. Представлені дані вказують на те, що КоА синтаза чинить позитивний вплив на сигнальні шляхи клітини, та виявляють невідомий раніше функціональний зв’язок між передаванням сигналів в клітині та метаболізмом.Цель. Оценка влияния уровня экспрессии, каталитической активности и субклеточной локализации КоА синтазы на независимый от контактов с внеклеточным матриксом рост и выживание клеток в культуре in vitro. Методы. В работе оценивали способность клеток формировать колонии в полужидкой агарозе и выживать в отсутствии ростовых факторов. Были созданы стабильные клеточные линии на основе клеток HEK293, которые надэкспресировали КоА синтазу дикого типа, а также мутантные – каталитически неактивную форму, либо КоА синтазу с делетированой последовательностью, отвечающей за ассоциацию с митохондриями. Исследовались также эффекты миРНК опосредованного снижения эндогенного уровня КоА синтазы на раковый фенотип клеток HepG2. Результаты. Изменения в уровне экспрессии КоА синтазы влияли на независимый от прикрепления рост и выживание клеток млекопитающих. Каталитическая активность КоА синтазы, а также ассоциация ее с митохондриями оказались необходимыми для опосредования наблюдаемых эффектов. Выводы. Представленные данные указывают, что КоА синтаза позитивно влияет на активность сигнальных путей в клетках млекопитающих, а также вскрывают неизвестную ранее функциональную связь между передачей сигналов в клетке и метаболизмом

Proline rich regions of coenzyme A synthase α and β interact with SH3 domains of signaling proteins in vitro

Coenzyme A-synthases α and β (CoASy α and CoASy β ) contain proline rich regions which may bring them into complexes with SH3-domain containing proteins. To test whether CoASy isoforms can bind to SH3 domains we performed in vitro pull down experiments. It was found that CoASy β N-terminal extension, which is especially abundant in prolines, can interact specifically and directly with SH3 domains of tyrosine kinases Fyn and CSK, phospholipase Cγ, NADPH oxidase activator 1 – p67phox, and cytoskeleton protein spectrin. Furthermore, C-terminal SH3 domain of p67phox can also interact with SH3 binding site that resides on the shared part of CoASyβ and CoASyα . These data demonstrated that CoA Synthases could be involved in complexes with signaling proteins in living cells which may regulate enzymatic activities of CoA Synthases or vice versa CoA Synthase may modulate some steps in signal transduction in the cell in currently unknown way.Кофермент А-синтази α та β містять збагачені проліном ділянки, які можуть сприяти їхньому комплексоутворенню з білками, що містять SH3 домени. Для перевірки цієї гіпотези ми провели експерименти in vitro по зв’язуванню повнорозмірного білка КоА-синтази α та специфічного для КоА-синтази β N-кінцевого пептиду із SH3 доменами сигнальних білків. Виявилося, що специфічний для КоА-синтази β N-кінцевий пептид, багатий на пролін, специфічно взаємодіє з SH3 доменами тирозинових протеїнкіназ Fyn і CSK, фосфоліпази Cγ , активатора NADPH оксидази 1 – p67phox і цитоскелетного білка спектрину. Крім того, SH3 домен p67phox зв’язується із збагаченою проліном послідовністю, спільною для обох ізоформ. Отримані результати дозволяють припустити, що КоА-cинтази α і β перебувають у комплексах з сигнальними білками і, таким чином, відбувається регуляція їхньої ферментативної активності або ж КоА-синтази невідомим на даний час способом модулюють певні етапи передавання сигналів у клітині.Кофермент А-синтазы α и β содержат богатые пролином области, возможно, способствующие их комплексообразованию с белками, содержащими SH3 домены. Для проверки этой гипотезы мы провели эксперименты по связыванию in vitro полноразмерного белка КоА-синтазы α и специфического для КоА-синтазы β N-концевого пептида с SH3 доменами сигнальных белков. Оказалось, что пролин-богатый N-концевой пептид КоА-синтазы βспецифически взаимодействует с SH3 доменами тирозиновых протеинкиназ Fyn и CSK, фосфолипазы Cγ, активатора NADPH оксидазы 1 – p67phox и белка цитоскелета спектрина. Кроме этого, SH3 домен p67phox взаимодействует с обогащенной пролином последовательностью, общей для обеих изоформ. Полученные результаты позволяют предположить, что КоА-синтазы α и β образуют комплексы с сигнальными белками и, таким образом, регулируется ферментативная активность КоА-синтаз либо же КоА-синтазы неизвестным на данный момент способом модулируют определенные этапы передачи сигналов в клетке

Proline rich regions of coenzyme A synthase α and β interact with SH3 domains of signaling proteins in vitro

Coenzyme A-synthases α and β (CoASy α and CoASy β ) contain proline rich regions which may bring them into complexes with SH3-domain containing proteins. To test whether CoASy isoforms can bind to SH3 domains we performed in vitro pull down experiments. It was found that CoASy β N-terminal extension, which is especially abundant in prolines, can interact specifically and directly with SH3 domains of tyrosine kinases Fyn and CSK, phospholipase Cγ, NADPH oxidase activator 1 – p67phox, and cytoskeleton protein spectrin. Furthermore, C-terminal SH3 domain of p67phox can also interact with SH3 binding site that resides on the shared part of CoASyβ and CoASyα . These data demonstrated that CoA Synthases could be involved in complexes with signaling proteins in living cells which may regulate enzymatic activities of CoA Synthases or vice versa CoA Synthase may modulate some steps in signal transduction in the cell in currently unknown way.Кофермент А-синтази α та β містять збагачені проліном ділянки, які можуть сприяти їхньому комплексоутворенню з білками, що містять SH3 домени. Для перевірки цієї гіпотези ми провели експерименти in vitro по зв’язуванню повнорозмірного білка КоА-синтази α та специфічного для КоА-синтази β N-кінцевого пептиду із SH3 доменами сигнальних білків. Виявилося, що специфічний для КоА-синтази β N-кінцевий пептид, багатий на пролін, специфічно взаємодіє з SH3 доменами тирозинових протеїнкіназ Fyn і CSK, фосфоліпази Cγ , активатора NADPH оксидази 1 – p67phox і цитоскелетного білка спектрину. Крім того, SH3 домен p67phox зв’язується із збагаченою проліном послідовністю, спільною для обох ізоформ. Отримані результати дозволяють припустити, що КоА-cинтази α і β перебувають у комплексах з сигнальними білками і, таким чином, відбувається регуляція їхньої ферментативної активності або ж КоА-синтази невідомим на даний час способом модулюють певні етапи передавання сигналів у клітині.Кофермент А-синтазы α и β содержат богатые пролином области, возможно, способствующие их комплексообразованию с белками, содержащими SH3 домены. Для проверки этой гипотезы мы провели эксперименты по связыванию in vitro полноразмерного белка КоА-синтазы α и специфического для КоА-синтазы β N-концевого пептида с SH3 доменами сигнальных белков. Оказалось, что пролин-богатый N-концевой пептид КоА-синтазы βспецифически взаимодействует с SH3 доменами тирозиновых протеинкиназ Fyn и CSK, фосфолипазы Cγ, активатора NADPH оксидазы 1 – p67phox и белка цитоскелета спектрина. Кроме этого, SH3 домен p67phox взаимодействует с обогащенной пролином последовательностью, общей для обеих изоформ. Полученные результаты позволяют предположить, что КоА-синтазы α и β образуют комплексы с сигнальными белками и, таким образом, регулируется ферментативная активность КоА-синтаз либо же КоА-синтазы неизвестным на данный момент способом модулируют определенные этапы передачи сигналов в клетке