Analyse von forensisch relevanten short tandem repeats (STRs) mittels massiver paralleler Sequenzierung (MPS) und Vergleich zum Standardverfahren Kapillarelektrophorese (CE)

One of the basic tasks of forensic genetics is the unambiguous assignment of a crime scene trace to a person using DNA profiles. For this purpose, short, repetitive regions of non-coding DNA are examined. These are called microsatellites or short tandem repeats (STRs). STRs differ from person to person in the number of their repeats. The combination of several STR markers in one STR-profile is necessary to identify a person unambiguously. Since the 1990s STR-profiles have been generated using capillary electrophoresis (CE), which is a quick and cost-effective method. This method reveals the length-based information only and complicates the simultaneous analysis of more than 30 markers in one analysis. To eliminate these disadvantages, the technology of massively parallel sequencing (MPS), also called next generation sequencing (NGS), has been applied in forensic genetics. MPS enables the simultaneous sequencing of currently 58 STR markers and reveals additional sequence information. My thesis focuses on the analysis of forensically relevant STR markers using MPS. First, the method was validated and compared to CE as part of two publications [1, 2], since concordant, reproducible results are of high importance for forensic DNA profiling. The published results show concordant and reproducible results across participating laboratories. However, the quality does not yet match the quality of CE analysis, showing increased drop-outs and stutter alleles, a poorer inter-locus- and heterozygote balance. Furthermore, inter-laboratory differences in the performance of the sequencing devices were revealed. In a further publication [3] I reviewed the advantages of sequence information (MPS) over length information (CE). I sequenced 64 father-son pairs to test whether MPS allows the detection of sequence variation and thus a further distinction of male relatives. Here, no additional sequence variations were detected between fathers and their respective sons. However, sequence variation was found between unrelated males, resulting in an increase of allele diversity of the Y-STR-markers. In addition, sequence information allowed the exact localization of length variations, which is helpful to improve the understanding of mutational events. An increase of allele diversity was also detected for autosomal STRs during the concordance studies [1]. This can facilitate the evaluation of complex mixed traces or of complex kinship cases. My thesis shows that the advantage of the MPS technology for forensic analysis is the gain of detectable DNA variability. This is relevant for specific forensic cases, and generally raises forensic DNA analysis to a new level.Eine der grundlegenden Aufgaben der Forensischen Genetik besteht in der eindeutigen Zuordnung einer Tatortspur zu einer Person anhand des DNA-Profils. Dazu werden kurze, sich wiederholende Bereiche der nichtcodierenden DNA untersucht, die als Mikrosatelliten oder short tandem repeats (STRs) bezeichnet werden. Sie unterscheiden sich von Person zu Person in der Anzahl ihrer Wiederholungen. Für die eindeutige Identifizierung einer Person ist die Kombination mehrerer STR-Marker in einem STR-Profil nötig, welches seit den 90er Jahren mit Hilfe der Kapillarelektrophorese (CE) erstellt wird. Diese Methode ist kostengünstig und zeitsparend, liefert allerdings nur die Information der unterschiedlichen Längen der Marker und erschwert die Kombination von mehr als 30 STR-Markern in einer Analyse. Um diese Nachteile zu eliminieren, wird seit einigen Jahren die Technologie massively parallel sequencing (MPS), auch next generation sequencing (NGS) genannt, in der Forensischen Genetik angewandt. Diese Technologie ermöglicht die gleichzeitige Sequenzierung von derzeit bis zu 58 STR-Markern sowie die Detektion zusätzlicher Sequenzvariationen dieser Marker. Meine Promotionsarbeit befasst sich mit der Analyse forensisch relevanter STR-Marker mittels MPS. Die technisch forensische Validierung der Methode ist Gegenstand zweier Publikationen [1, 2]. Hier wurde die STR-Sequenzierung mit der Standard-Methode CE verglichen, da konkordante, reproduzierbare Ergebnisse für die Erstellung forensischer DNA-Profile von hoher Bedeutung sind. Dabei stellte sich heraus, dass MPS laborübergreifend konkordante und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Die Qualität entspricht allerdings noch nicht vollständig derjenigen der CE-Analyse, was sich in vermehrten Allel-Ausfällen (drop-outs) und Stotterallelen sowie einer suboptimalen inter-locus und heterozygote balance widerspiegelt. Des Weiteren wurden laborübergreifende Unterschiede der Geräteleistung der Sequenzierplattform aufgedeckt. Anschließend überprüfte ich, welche Vorteile die Sequenzinformation (MPS) gegenüber der Längeninformation (CE) für die forensische Anwendung bringt. Dazu publizierte ich eine weitere Studie [3] zur Sequenzierung Y-chromosomal lokalisierter STR-Profile von 64 Vater-Sohn-Paaren, um zu prüfen, ob MPS das Aufdecken von Sequenzvariationen und somit die weitere Unterscheidung männlicher Verwandter ermöglicht. Es wurden keine zusätzlichen Sequenzvariationen zwischen Vätern und ihren jeweiligen Söhnen detektiert. Jedoch wurden Sequenzvariationen zwischen nicht verwandten Männern festgestellt, wodurch die Allel-Diversität der Y-STR-Marker und damit das Individualisierungspotential erhöht wird. Die Sequenzinformation der STRs ermöglichte außerdem die genaue Lokalisation der Längenvariationen, was hilfreich ist, um Mutationsereignisse besser zu verstehen. Eine Erhöhung der Diversität wurde anhand der Konkordanzstudien auch für autosomale STRs festgestellt [1]. Dadurch kann die Auswertung von komplexen Mischspuren oder von komplexen Verwandtschaftsstrukturen erleichtert werden. Meine Promotionsarbeit zeigt, dass der Vorteil der MPS-Technologie eindeutig im Informationsgewinn liegt und damit die forensische Spuren-Analyse auf ein neues Niveau hebt

Inter-laboratory study on standardized MPS libraries : evaluation of performance, concordance, and sensitivity using mixtures and degraded DNA

We present results from an inter-laboratory massively parallel sequencing (MPS) study in the framework of the SeqForSTRs project to evaluate forensically relevant parameters, such as performance, concordance, and sensitivity, using a standardized sequencing library including reference material, mixtures, and ancient DNA samples. The standardized library was prepared using the ForenSeq DNA Signature Prep Kit (primer mix A). The library was shared between eight European laboratories located in Austria, France, Germany, The Netherlands, and Sweden to perform MPS on their particular MiSeq FGx sequencers. Despite variation in performance between sequencing runs, all laboratories obtained quality metrics that fell within the manufacturer’s recommended ranges. Furthermore, differences in locus coverage did not inevitably adversely affect heterozygous balance. Inter-laboratory concordance showed 100% concordant genotypes for the included autosomal and Y-STRs, and still, X-STR concordance exceeded 83%. The exclusive reasons for X-STR discordances were drop-outs at DXS10103. Sensitivity experiments demonstrated that correct allele calling varied between sequencing instruments in particular for lower DNA amounts (≤ 125 pg). The analysis of compromised DNA samples showed the drop-out of one sample (FA10013B01A) while for the remaining three degraded DNA samples MPS was able to successfully type ≥ 87% of all aSTRs, ≥ 78% of all Y-STRs, ≥ 68% of all X-STRs, and ≥ 92% of all iSNPs demonstrating that MPS is a promising tool for human identity testing, which in return, has to undergo rigorous in-house validation before it can be implemented into forensic routine casework