Caracterización de vesículas extracelulares como mediadoras de la comunicación intercelular en el microambiente tumoral tiroideo y su rol en la promoción maligna

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2021El cáncer de tiroides es la enfermedad maligna del sistema endocrino con mayor prevalencia. Entre los carcinomas tiroideos, el Carcinoma Papilar Tiroideo (PTC) es la patología más frecuente, en general de buen pronóstico, aunque algunos casos se presentan con mayor agresividad, metástasis locales y a distancia, resistencia al tratamiento y aumentada mortalidad. Por otra parte, el Carcinoma Anaplásico Tiroideo (ATC), aunque de menor incidencia, es el más agresivo, metastásico y de alta letalidad. Las células tumorales no pueden comandar la promoción de la enfermedad de forma independiente, sino que necesitan de otras células, residentes o reclutadas al sitio tumoral, que apoyen el mantenimiento de las capacidades adquiridas por las células tumorales, conformándose lo que se conoce como microambiente tumoral (TME). La comunicación intercelular en el TME se produce tanto por interacciones célula-célula, célula-matriz, como por diversas moléculas liberadas en forma soluble o bien empaquetadas en vesículas extracelulares (EVs). Las EVs son poblaciones heterogéneas de vesículas nanométricas (< 1000 nm) y transportan biomoléculas provenientes de la célula que les da origen. Las EVs liberadas por las células al espacio extracelular pueden ser aisladas a partir de distintos fluidos biológicos o sobrenadantes de cultivo, transferir su cargo a células receptoras, regulando el estado fisiopatológico de éstas, contribuir al desarrollo tumoral y participar en la invasión y metástasis en ganglios centinelas. El papel del TME en el desarrollo del cáncer de tiroides está comenzando a ser dilucidado. Sin embargo, las evidencias que relacionan el crosstalk entre Fb y células tumorales tiroideas, con la secreción de EVs, su cargo, y eventual modulación de proteínas relacionadas con la promoción de la invasión y diseminación tumoral, fueron poco exploradas. Este trabajo de tesis doctoral se centró en la caracterización de EVs, obtenidas a partir de un modelo in vitro de interacción célula tumoral-Fb, desde un abordaje morfológico, cuantitativo, bioquímico, proteómico y funcional. Los fibroblastos (Fb), fueron las células representantes del estroma elegidas en este trabajo, y se conoce que presentan un rol protagónico en el desarrollo tumoral. El modelo experimental utilizado se basó en el co-cultivo de células TPC-1 (PTC); 8505c, (ATC); y NThyOri (células no-tumorales tiroideas) con Fb humanos; y el aislamiento de EVs se llevó a cabo por ultracentrifugación de los sobrenadantes de cultivo (CMs). La caracterización morfológica y bioquímica de las EVs se realizó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA) y ensayos de western blot (WB). El estudio proteómico se realizó por cromatografía líquida de alto rendimiento y espectrometría de masa en tándem y la caracterización funcional por zimografías, microscopía de fluorescencia, microscopía confocal y citometría de flujo. Estudios proteómicos y funcionales de las EVs permitieron dilucidar su posible rol en el TME tiroideo, así como encontrar interesantes proteínas que constituirían importantes blancos de profundización como biomarcadores en cáncer de tiroides. Los resultados obtenidos demostraron que los Fb, las células tiroideas y sus co-cultivos liberan EVs a los CMs, con un tamaño entre 50-200nm, las que mostraron la expresión de marcadores de exosomas clásicos. La comunicación bidireccional entre Fb y células TPC-1, produjo un mayor número de EVs que las obtenidas de Fb y células TPC-1 aisladas. Sin embargo, no hubo diferencias en el número y tamaño de las partículas aisladas entre las diferentes células tiroideas co-cultivadas. El perfil proteómico de las EVs distinguió aquellas obtenidas de células co-cultivadas con respecto a las obtenidas de células aisladas y mostró una robusta segregación entre las muestras provenientes del entorno del PTC: TPC-1/Fb-TPC-1 con respecto a las provenientes de 8505c/Fb-8505c y NThyOri/Fb-NThyOri. Interesantemente, EVs provenientes del co-cultivo célula tumoral tiroidea-Fb presentaron un perfil proteómico relacionado a la remodelación de la matriz extracelular (ECM). El estudio de las proteínas diferencialmente enriquecidas (DEPs) en el entorno Fb-TPC-1, sugirió que el Fb aportaría al direccionamiento de la potencial funcionalidad en las EVs, sin embargo, en el contexto Fb-8505c, el Fb no modificaría la capacidad funcional que presentan EVs obtenidas de 8505c aisladas. En concordancia, el crosstalk entre Fb y TPC-1 potenció el rol de las EVs favoreciendo la degradación del colágeno. En la remodelación de la ECM participan enzimas como las metaloproteinasas (MMPs), proteasas inducidas y secretadas por células presentes en el TME. En el medio extracelular, éstas se activan y remodelan la ECM, degradando el colágeno contenido en la misma, favoreciendo los pasos iniciales de la migración celular. En nuestro modelo, se evidenció que el co-cultivo célula tumoral tiroidea-Fb indujo la secreción de proMMP9 y proMMP2 junto a un aumento significativo en la activación de MMP2 en los CMs. Además, en el caso de Fb-TPC-1, este aumento en la secreción de la enzima y su activación se produjo aún en ausencia del contacto directo célula-célula, mediado posiblemente por EVs y factores solubles liberados en ese contexto. De la misma manera, se demostró que la incubación de Fb y células NThyOri con EVs provenientes de Fb-TPC-1 indujo la secreción y activación de MMP2 en los CMs. En consonancia, MMP2 y proteínas relacionadas a la misma, detectadas en las EVs, permitieron discriminar entre EVs provenientes de un entorno tumoral con respecto al no tumoral. Por otro lado, se pudo evidenciar un aumento en el mRNA de GAL-1 en Fb estimulados con EVs provenientes de Fb-TPC-1. En estudios de captación de EVs realizados utilizando Fb y células TPC-1, como células receptoras, se evidenció que las EVs producidas por Fb, células tumorales y no tumorales tiroideas, son incorporadas al interior celular. Curiosamente, un mayor número de Fb internalizaron EVs provenientes del entorno tumoral que de células no tumorales tiroideas, lo que puso en evidencia la activa comunicación intercelular entre Fb y células tumorales tiroideas a través de EVs. Por último, CD147, HRAS y MAMDC2, moléculas asociadas con agresividad tumoral, se detectaron exclusivamente enriquecidas en EVs provenientes de Fb-TPC-1, lo cual abre la oportunidad de su estudio y detección en EVs provenientes de pacientes con cáncer de tiroides, con un potencial impacto traslacional en salud humana. En su conjunto, los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral nos permitieron demostrar, por primera vez, el impacto de la interacción tumor-Fb en la liberación de una subpoblación diferente de EVs en el TME tiroideo. En este sentido, la comunicación entre Fb y células tumorales tiroideas, produce EVs con un proteoma biológicamente relevante para el cáncer de tiroides, vinculado con la remodelación de la ECM y la degradación del colágeno contenido en la misma. En el TME tiroideo, estas EVs desempeñarían un rol activo en la síntesis y activación de MMPs, así como en la expresión de Gal-1, facilitando la degradación de la ECM y, potencialmente, la migración e invasión de las células tumorales promoviendo la agresividad y progresión del tumor. Tanto el conocimiento del cargo proteico presente en EVs, así como la comprensión de su función biológica en el TME tiroideo, podrían contribuir al diseño de nuevas estrategias de tratamiento y ofrecerían oportunidades en el uso de procedimientos mínimamente invasivos, para el descubrimiento de biomarcadores en biopsia líquida, potencialmente útiles en la evaluación diagnóstica y el seguimiento de los pacientes con cáncer de tiroides.Abstract: Thyroid cancer is the most prevalent malignant disease of the endocrine system. Among thyroid carcinomas, Papillary Thyroid Carcinoma (PTC) is the most frequent pathology, generally with a good prognosis, although some cases present higher aggressiveness, local and distant metastasis, resistance to treatment and increased mortality. On the other hand, Anaplastic Thyroid Carcinoma (ATC), although of lower incidence, is the most aggressive, metastatic and lethal malignancy. Tumor cells are not able to command independently the promotion of the disease, but need other cells, resident or permanently recruited to the tumor site, to support the maintenance of the hallmarks of cancer, establishing the tumor microenvironment (TME). Fibroblasts (Fb) were the representing stroma cells selected in this work, and they play a leading role in tumor development. Intercellular communication in the TME is produced by cell-to-cell and cell-matrix interactions, as well as by several molecules released in soluble form or packaged in extracellular vesicles (EVs). EVs are heterogeneous populations of nanometric vesicles (< 1000 nm) that carry biomolecules of their producing cells and transfer their cargo to recipient cells, regulating their pathophysiological state. EVs are released by the cells into the extracellular space, they can be identified in culture supernatants or different biological fluids, and contribute to tumor development modifying the phenotype of other TME cells and participating in invasion and metastasis to sentinel lymph nodes. The role of TME in thyroid cancer development is beginning to be elucidated. However, evidence linking the crosstalk between Fb and thyroid tumor cells with the secretion of EVs, their cargo, and an eventual modulation of proteins related to the promotion of tumor invasion and metastasis, still needs to be deciphered. This thesis work is focused on the characterization of EVs, obtained from an in vitro model of tumor cell-Fb interaction, with a morphological, quantitative, biochemical, proteomic and functional approach. The experimental model was based on the co-culture of TPC-1 cells, from PTC; 8505c, from ATC; and NThyOri, as thyroid non-tumor cells, with human Fb; and EVs were obtained by ultracentrifugation of culture supernatants (CMs). Morphological and biochemical characterization of EVs was performed by transmission electron microscopy (TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA) and western blot (WB). EV-proteomic analysis was performed by nano-liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and metalloproteinases (MMPs) were studied by zymography. EV-exchange was evaluated using immunofluorescence, confocal microscopy, and flow cytometry. Proteomic and functional studies of EVs permitted to elucidate their possible role in thyroid TME, as well as to find interesting proteins that would constitute important targets for further studies as thyroid cancer biomarkers. Our data demonstrated that Fb, thyroid cells and their co-cultures release EVs to CMs, with a size that ranged from 50 to 200nm, which showed the expression of the classical exosome markers CD63, CD81, CD9, and FLOT-1. The crosstalk between Fb and TPC-1 cells produced significantly more EVs than their isolated cells, however, no significant differences were registered among the different co-cultured thyroid cells. Unsupervised hierarchical clustering of the proteomic data showed the robust segregation between TPC-1/Fb-TPC-1 EV-samples regarding 8505c/Fb-8505c and NThyOri/Fb-NThyOri EV-samples. Interestingly, EVs from thyroid tumor cell-Fb co-culture presented a proteomic profile related to extracellular matrix remodeling (ECM). The study of differentially enriched proteins (DEPs) in the Fb-TPC-1 environment suggests that Fb would provide a functional advantage to EVs from TPC-1-tumoral milieu, specializing them in direct communication with the ECM. However, in the 8505c-tumoral context, Fb would not modify the functional capacity2023-11-30Fil: Bravo Miana, Rocío del Carmen. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Fil: Bollati, Flavia Andrea. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina.Fil: Bollati, Flavia Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina.Fil: Pellizas, Claudia Gabriela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina.Fil: Pellizas, Claudia Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.Fil: Vilcaes, Aldo Alejandro. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.Fil: Vilcaes, Aldo Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.Fil: Cremaschi, Graciela Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay; Argentina.Fil: Cremaschi, Graciela Alicia. Pontificia Universidad Católica Argentina; Argentina.Fil: Cremaschi, Graciela Alicia. Consejo Nacional Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Biomédicas; Argentina

Expression of bone morphogenetic protein receptors in bovine oviductal epithelial cells: Evidence of autocrine BMP signaling

Members of the transforming growth factor beta (TGF-β) family, including bone morphogenetic proteins (BMPs), are expressed in the epithelial cells of the mammalian oviduct. These signaling molecules play important roles in development and tissue homeostasis; however, little is known about their function in the mammalian oviduct. In the present study, RT-qPCR was used to analyze the mRNA abundance of BMP type I (BMPR1A, BMPR1B, ACVR1) and type II receptors (BMPR2, ACVR2A, ACVR2B) in the bovine oviduct epithelial cells (BOEC) isolated from ampulla and isthmus at both the follicular (FP) and the luteal (LP) phase of the estrous cycle. Results indicate that mRNAs for all the BMP receptors studied are expressed in the BOEC. Significant mRNA abundance differences were observed for both BMPR1B and ACVR2B when comparing both the ampulla and isthmus regions with the greater abundance at the isthmus. When both FP and LP samples were compared, ACVR2B mRNA showed greater abundance during the LP, with significant differences in the isthmus region. These variations highlight differences between the isthmus and ampulla regions of the oviduct. By means of wound healing assays on BOEC primary cultures, exogenous recombinant human BMP5 induced a significant increase in wound healing at 24 h. The observed changes at the mRNA abundance of components of the signaling pathway and the BMP5 effect on oviductal epithelial cells suggest a possible autocrine role for the BMP pathway that could affect epithelial cell functions necessary for normal physiology and reproductive success in BOEC homeostasis.Fil: Valdecantos, Pablo Alberto. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Biología; ArgentinaFil: Bravo Miana, Rocío del Carmen. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Biología; ArgentinaFil: Garcia, Elina Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Biología; ArgentinaFil: Garcia, Daniela Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Biología; ArgentinaFil: Roldan Olarte, Eugenia Mariela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Biología; ArgentinaFil: Miceli, Dora Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Biología; Argentin

Thyroid tumor cells-fibroblasts crosstalk: Role of extracellular vesicles

Tumor-stroma crosstalk leads to a tumor-promoting microenvironment. In this milieu, extracellular vesicles (EVs) are protagonists in cell-cell communication. Despite thyroid cancer being the most common endocrine malignancy, the contribution of the tumor microenvironment to thyroid cancer progression is still largely underexplored. We focused on the role of thyroid tumor cell-fibroblast interaction and EVs as mediators of tumor-stroma interplay, in the promotion of thyroid tumor aggressiveness. Thyroid tumor (TPC-1, 8505c) or non-tumor thyroid cells (NThyOri) were co-cultured with human fibroblasts (Fb). Thyroid cell migration was investigated by the wound-healing assay and actin-network staining. Cell-CD147 expression was characterized by flow cytometry. EVs, obtained by ultracentrifugation of conditioned media (CMs), were characterized by transmission electron-microscopy and CD81 and CD147 expression. Metalloproteinases (MMPs) were evaluated by zymography in CMs. A migratory phenotype was triggered in thyroid tumor cells treated with CMs from Fb or from Fb-thyroid tumor cell co-cultures. Fb-thyroid cell co-cultures induced the secretion of proMMP9 and proMMP2 and led to a significant MMP2 activation in CMs. Fb, thyroid cells and Fb-thyroid cell co-cultures released EVs, and remarkably, EVs released by Fb-thyroid tumor cell co-cultures induced the secretion of proMMP2 and the expression of MMP2 from normal Fb. A significant CD147 expression was demonstrated in Fb-thyroid tumor cell-derived EVs. These findings reveal the role of Fb and thyroid tumor cell-Fb interaction in the promotion of a microenvironment suitable for thyroid tumor progression. Moreover, they highlight, for the first time, the role of thyroid tumor cell-Fb interaction in the production of specialized EVs.Fil: Bravo Miana, Rocío del Carmen. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; ArgentinaFil: Della Vedova, Ana Belen. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: de Paul, Ana Lucia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Medicina. Centro de Microscopía Electrónica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud; ArgentinaFil: Remedi, Maria Monica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; ArgentinaFil: Guantay, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Gilardoni, Mónica Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Pellizas, Claudia Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Donadio, Ana Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentin