Die Rolle der Gengrenzen in der Transkriptionsregulation von Zaire Ebolavirus

Die sieben Gene des Zaire Ebolavirus (ZEBOV) werden im RNA-Genom durch hoch konservierte Transkriptionsstartsignale und –stoppsignale flankiert. An den Gengrenzen treffen das Stoppsignal des vorangehenden und das Startsignal des nachfolgenden Gens in unterschiedlicher Weise aufeinander. Entweder überlappen die beiden Signale, oder sie sind über nicht transkribierte intergenische Regionen (IRs) variabler Länge und Sequenz getrennt. Nicht segmentierte negativ-strängige RNA-Viren besitzen nur einen am 3’-Ende des Genoms gelegenen Transkriptionspromotor. Einzig die cis-aktiven Signale an den Gengrenzen steuern somit über Interaktion mit dem viralen Polymerasekomplex alle bei der Transkription ablaufenden Prozesse, wie die Termination und Reinitiation der Transkription sowie das Capping und Polyadenylieren der mRNA. Eine Möglichkeit, die Syntheserate viraler mRNA und damit die Produktion viraler Proteine zu regulieren, ist, die Bildung polycistronischer (Readthrough-) mRNAs durch das Überlesen von Transkriptionsstoppsignalen zu induzieren. Diesen wird eine Rolle bei der spezifischen Reduktion einzelner Genprodukte zugeschrieben, da sie schlecht translatiert werden. Solche Transkripte waren bislang für ZEBOV nicht beschrieben, konnten im Rahmen dieser Arbeit jedoch in mit Virus infizierten Zellen nachgewiesen werden. Dabei war interessant, dass sie unabhängig von der Struktur der Gengrenzen, also sowohl bei solchen mit überlappenden als auch mit durch IR getrennten Transkriptionssignalen, gebildet wurden. Um nun der Frage weiter nachzugehen, inwieweit die Transkriptionsaktivität über die unterschiedlich strukturierten Gengrenzen reguliert wird, wurden bicistronische Minigenome eingesetzt. In diesen sind zwei Reportergene durch ZEBOV-spezifische Gengrenzen voneinander separiert. Zunächst wurde die Transkriptionsaktivität von Minigenomen mit unterschiedlichen Wildtyp-Gengrenzen (IR 5nt, IR 144nt und eine Überlappung) untersucht. Dies erfolgte sowohl in mit ZEBOV infizierten Zellen als auch in einem rekonstruierten ZEBOV-spezifischen Replikations- und Transkriptionssystem. Interessanterweise deuteten die Ergebnisse übereinstimmend auf eine durch die IRs beeinflusste Regulation der Transkription hin, da die Reinitiationsfrequenz bei einer Gengrenze mit einer langen IR am niedrigsten war. Viele Negativstrang-RNA-Viren nutzen die intergenischen Regionen, um die Erkennung der angrenzenden Transkriptionssignale zu regulieren. Da die Transkriptionssignale bei ZEBOV sehr hoch konserviert sind, die IRs jedoch variabel, legte das einen Einfluss auf die Erkennung der angrenzenden Signale nahe. Erstaunlicherweise führte jedoch die Deletion, Substitution oder Verlängerung der beiden untersuchten IRs nicht zu einem Verlust der Genexpression. Daraus folgt, dass die IRs in ZEBOV für die Expression angrenzender Gene nicht essentiell sind. Die Analyse der transkribierten mRNA sowie die Quantifizierung der gebildeten Proteinmenge bestätigten allerdings, dass die IRs die Reinitiationsfrequenz am nachfolgenden Gen regulieren. Die Sequenz der IR konnte dabei als maßgeblicher Faktor ausgeschlossen werden. Vielmehr spielte die IR-Länge eine bedeutende Rolle. Entgegen den Erwartungen ließ sich hierbei keine direkte Korrelation zwischen IR-Länge und Reinitiationsfrequenz feststellen, wie sie für andere Viren beschrieben wird. Vielmehr konnte für beide untersuchten Gengrenzen bei IRs von 10-30 Nukleotiden Länge eine starke Reduktion des Neustartens beobachtet werden, während eine Inhibition der Reinitiation bei IR-Längen von 5 oder >40 Nukleotiden nicht auftrat. Die Hemmung der viralen Polymerase über IRs bestimmter Länge konnte auch in der Virusinfektion bestätigt werden. Eine derartige Regulation ist bislang bei anderen Viren nicht bekannt. Dies könnte auf eine für ZEBOV einmalige Erkennung der Startsignale hindeuten, die von der spezifischen Verpackungseinheit des Genoms abhängig ist. An zwei Gengrenzen im ZEBOV-Genom überlappen die Transkriptionssignale aufeinander folgender Gene, wobei sie sich ein hoch konserviertes Pentamer teilen. Diese Gengrenzstruktur ist für Filoviren einzigartig. Aufgrund der Überlappung trifft die virale Polymerase bei der Transkription zuerst auf das Startsignal des stromabwärts liegenden Gens, bevor sie zu dem Stoppsignal des stromaufwärts liegenden Gens gelangt. Eine Mutation des Transkriptionsstartsignals beeinflusste die Erkennung des überlappenden Transkriptionsstoppsignals nicht. Hingegen war ein funktionelles Stoppsignal essentiell für die Reinitiation am überlappenden Startsignal. Stoppen und Neustarten sind somit in ZEBOV funktionell miteinander verknüpft, was den generellen Ablauf der Transkription nach einem für alle nicht segmentierten negativ-strängigen RNA Viren beschriebenen Modell bestätigen konnte. Eine Insertionsmutagenese an dieser Gengrenze verschob das überlappende Startsignal stromaufwärts. Die Untersuchung der gebildeten mRNA zeigte, dass die filovirale Polymerase in der Lage war, überlappende Transkriptionssignale effizient zu erkennen, die in umgedrehter Reihenfolge durch bis zu 21 Nukleotide getrennt vorlagen. In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass auch die Filoviren bei Stoppen und Neustarten der Transkription einem generell für alle negativ-strängigen nicht segmentierten RNA-Viren vorgeschlagenen Modell zu folgen scheinen. Dennoch weisen die Ergebnisse auf für Filoviren einzigartige, komplexe Regulationsmechanismen hin, die eine spezifische Kontrolle der viralen Polymerase über die an den Gengrenzen gelegenen cis-aktiven Signale nahe legen

Virus nomenclature below the species level : a standardized nomenclature for filovirus strains and variants rescued from cDNA

Specific alterations (mutations, deletions, insertions) of virus genomes are crucial for the functional characterization of their regulatory elements and their expression products, as well as a prerequisite for the creation of attenuated viruses that could serve as vaccine candidates. Virus genome tailoring can be performed either by using traditionally cloned genomes as starting materials, followed by site-directed mutagenesis, or by de novo synthesis of modified virus genomes or parts thereof. A systematic nomenclature for such recombinant viruses is necessary to set them apart from wild-type and laboratoryadapted viruses, and to improve communication and collaborations among researchers who may want to use recombinant viruses or create novel viruses based on them. A large group of filovirus experts has recently proposed nomenclatures for natural and laboratory animal-adapted filoviruses that aim to simplify the retrieval of sequence data from electronic databases. Here, this work is extended to include nomenclature for filoviruses obtained in the laboratory via reverse genetics systems. The previously developed template for natural filovirus genetic variant naming,\virus name[(\strain[/)\isolation host-suffix[/ \country of sampling[/\year of sampling[/\genetic variant designation[-\isolate designation[, is retained, but we propose to adapt the type of information added to each field for cDNA clone-derived filoviruses. For instance, the full-length designation of an Ebola virus Kikwit variant rescued from a plasmid developed at the US Centers for Disease Control and Prevention could be akin to ‘‘Ebola virus H.sapiens-rec/COD/1995/Kikwit-abc1’’ (with the suffix ‘‘rec’’ identifying the recombinant nature of the virus and ‘‘abc1’’ being a placeholder for any meaningful isolate designator). Such a full-length designation should be used in databases and the methods section of publications. Shortened designations (such as ‘‘EBOV H.sap/COD/95/ Kik-abc1’’) and abbreviations (such as ‘‘EBOV/Kik-abc1’’) could be used in the remainder of the text, depending on how critical it is to convey information contained in the full-length name. ‘‘EBOV’’ would suffice if only one EBOV strain/variant/isolate is addressed.http://link.springer.com/journal/705hb201

Die Rolle der Gengrenzen in der Transkriptionsregulation von Zaire Ebolavirus

Die sieben Gene des Zaire Ebolavirus (ZEBOV) werden im RNA-Genom durch hoch konservierte Transkriptionsstartsignale und –stoppsignale flankiert. An den Gengrenzen treffen das Stoppsignal des vorangehenden und das Startsignal des nachfolgenden Gens in unterschiedlicher Weise aufeinander. Entweder überlappen die beiden Signale, oder sie sind über nicht transkribierte intergenische Regionen (IRs) variabler Länge und Sequenz getrennt. Nicht segmentierte negativ-strängige RNA-Viren besitzen nur einen am 3’-Ende des Genoms gelegenen Transkriptionspromotor. Einzig die cis-aktiven Signale an den Gengrenzen steuern somit über Interaktion mit dem viralen Polymerasekomplex alle bei der Transkription ablaufenden Prozesse, wie die Termination und Reinitiation der Transkription sowie das Capping und Polyadenylieren der mRNA. Eine Möglichkeit, die Syntheserate viraler mRNA und damit die Produktion viraler Proteine zu regulieren, ist, die Bildung polycistronischer (Readthrough-) mRNAs durch das Überlesen von Transkriptionsstoppsignalen zu induzieren. Diesen wird eine Rolle bei der spezifischen Reduktion einzelner Genprodukte zugeschrieben, da sie schlecht translatiert werden. Solche Transkripte waren bislang für ZEBOV nicht beschrieben, konnten im Rahmen dieser Arbeit jedoch in mit Virus infizierten Zellen nachgewiesen werden. Dabei war interessant, dass sie unabhängig von der Struktur der Gengrenzen, also sowohl bei solchen mit überlappenden als auch mit durch IR getrennten Transkriptionssignalen, gebildet wurden. Um nun der Frage weiter nachzugehen, inwieweit die Transkriptionsaktivität über die unterschiedlich strukturierten Gengrenzen reguliert wird, wurden bicistronische Minigenome eingesetzt. In diesen sind zwei Reportergene durch ZEBOV-spezifische Gengrenzen voneinander separiert. Zunächst wurde die Transkriptionsaktivität von Minigenomen mit unterschiedlichen Wildtyp-Gengrenzen (IR 5nt, IR 144nt und eine Überlappung) untersucht. Dies erfolgte sowohl in mit ZEBOV infizierten Zellen als auch in einem rekonstruierten ZEBOV-spezifischen Replikations- und Transkriptionssystem. Interessanterweise deuteten die Ergebnisse übereinstimmend auf eine durch die IRs beeinflusste Regulation der Transkription hin, da die Reinitiationsfrequenz bei einer Gengrenze mit einer langen IR am niedrigsten war. Viele Negativstrang-RNA-Viren nutzen die intergenischen Regionen, um die Erkennung der angrenzenden Transkriptionssignale zu regulieren. Da die Transkriptionssignale bei ZEBOV sehr hoch konserviert sind, die IRs jedoch variabel, legte das einen Einfluss auf die Erkennung der angrenzenden Signale nahe. Erstaunlicherweise führte jedoch die Deletion, Substitution oder Verlängerung der beiden untersuchten IRs nicht zu einem Verlust der Genexpression. Daraus folgt, dass die IRs in ZEBOV für die Expression angrenzender Gene nicht essentiell sind. Die Analyse der transkribierten mRNA sowie die Quantifizierung der gebildeten Proteinmenge bestätigten allerdings, dass die IRs die Reinitiationsfrequenz am nachfolgenden Gen regulieren. Die Sequenz der IR konnte dabei als maßgeblicher Faktor ausgeschlossen werden. Vielmehr spielte die IR-Länge eine bedeutende Rolle. Entgegen den Erwartungen ließ sich hierbei keine direkte Korrelation zwischen IR-Länge und Reinitiationsfrequenz feststellen, wie sie für andere Viren beschrieben wird. Vielmehr konnte für beide untersuchten Gengrenzen bei IRs von 10-30 Nukleotiden Länge eine starke Reduktion des Neustartens beobachtet werden, während eine Inhibition der Reinitiation bei IR-Längen von 5 oder >40 Nukleotiden nicht auftrat. Die Hemmung der viralen Polymerase über IRs bestimmter Länge konnte auch in der Virusinfektion bestätigt werden. Eine derartige Regulation ist bislang bei anderen Viren nicht bekannt. Dies könnte auf eine für ZEBOV einmalige Erkennung der Startsignale hindeuten, die von der spezifischen Verpackungseinheit des Genoms abhängig ist. An zwei Gengrenzen im ZEBOV-Genom überlappen die Transkriptionssignale aufeinander folgender Gene, wobei sie sich ein hoch konserviertes Pentamer teilen. Diese Gengrenzstruktur ist für Filoviren einzigartig. Aufgrund der Überlappung trifft die virale Polymerase bei der Transkription zuerst auf das Startsignal des stromabwärts liegenden Gens, bevor sie zu dem Stoppsignal des stromaufwärts liegenden Gens gelangt. Eine Mutation des Transkriptionsstartsignals beeinflusste die Erkennung des überlappenden Transkriptionsstoppsignals nicht. Hingegen war ein funktionelles Stoppsignal essentiell für die Reinitiation am überlappenden Startsignal. Stoppen und Neustarten sind somit in ZEBOV funktionell miteinander verknüpft, was den generellen Ablauf der Transkription nach einem für alle nicht segmentierten negativ-strängigen RNA Viren beschriebenen Modell bestätigen konnte. Eine Insertionsmutagenese an dieser Gengrenze verschob das überlappende Startsignal stromaufwärts. Die Untersuchung der gebildeten mRNA zeigte, dass die filovirale Polymerase in der Lage war, überlappende Transkriptionssignale effizient zu erkennen, die in umgedrehter Reihenfolge durch bis zu 21 Nukleotide getrennt vorlagen. In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass auch die Filoviren bei Stoppen und Neustarten der Transkription einem generell für alle negativ-strängigen nicht segmentierten RNA-Viren vorgeschlagenen Modell zu folgen scheinen. Dennoch weisen die Ergebnisse auf für Filoviren einzigartige, komplexe Regulationsmechanismen hin, die eine spezifische Kontrolle der viralen Polymerase über die an den Gengrenzen gelegenen cis-aktiven Signale nahe legen

Nonradioactive northern blot analysis to detect ebola virus minigenomic mRNA

In this chapter, we describe the detection of Ebola virus minigenomic mRNA using a nonradioactive Northern hybridization. This protocol comprises all steps beginning with the synthesis of a digoxigenin-labeled riboprobe, harvest of transcribed mRNA from cells transfected with the Ebola virus minigenome system, separation of mRNA species by denaturing RNA gel electrophoresis, transfer of the mRNA to nylon membranes by vacuum blotting, and finally the detection of minigenome-specific mRNA through hybridization with a labeled riboprobe directed against the reporter gene. This method allows the direct study of cis-acting regulatory regions as well as trans-acting factors involved in Ebola virus minigenome transcription compared to the indirect measurement of reporter protein activity that additionally reflects translational effects (see Chapter 6 in this book for details)

Role of N-Linked Glycans on Bunyamwera Virus Glycoproteins in Intracellular Trafficking, Protein Folding, and Virus Infectivity

The membrane glycoproteins (Gn and Gc) of Bunyamwera virus (BUN, family Bunyaviridae) contain three potential sites for the attachment of N-linked glycans: one site (N60) on Gn and two (N624 and N1169) on Gc. We determined that all three sites are glycosylated. Digestion of the glycoproteins with endo-β-N-acetylglucosaminidase H (endo H) or peptide:N-glycosidase F revealed that Gn and Gc differ significantly in their glycan status and that late in infection Gc glycans remain endo H sensitive. The roles of the N-glycans in intracellular trafficking of the glycoproteins to the Golgi, protein folding, and virus replication were investigated by mutational analysis and confocal immunofluorescence. Elimination of the glycan on Gn, by changing N60 to a Q residue, resulted in the protein misfolding and failure of both Gn and Gc proteins to traffic to the Golgi complex. We were unable to rescue a viable virus by reverse genetics from a cDNA containing the N60Q mutation. In contrast, mutant Gc proteins lacking glycans on either N624 or N1169, or both sites, were able to target to the Golgi. Gc proteins containing mutations N624Q and N1169Q acquired endo H resistance. Three viable N glycosylation-site-deficient viruses, lacking glycans on one site or both sites on Gc, were created by reverse genetics. The viability of these recombinant viruses and analysis of growth kinetics indicates that the glycans on Gc are not essential for BUN replication, but they do contribute to the efficiency of virus infection

Modeling ebola virus genome replication and transcription with minigenome systems

In this chapter, we describe the minigenome system for Ebola virus (EBOV), which reconstitutes EBOV polymerase activity in cells and can be used to model viral genome replication and transcription. This protocol comprises all steps including cell culture, plasmid preparation, transfection, and luciferase reporter assay readout

FILOVIRUS TRANSCRIPTION AND REPLICATION

Filoviruses belong to the group of nonsegmented, negative-sense (NNS) RNA viruses and are members of the order Mononegavirales along with the rhabdo-, paramyxo-, nyami-, and bornaviruses. Mononegaviruses share a general mechanism to replicate and transcribe their genomes, reflected in functionally homologous proteins and a similar genome structure. Although basic mechanisms are similar between rhabdo- and filoviral RNA synthesis, both virus families have developed distinct features. In this chapter, we describe the concepts underlying filovirus replication and transcription. We introduce the technologies that have enabled scientists to decipher the viral replication cycle and discuss recent insights in the regulation of filoviral RNA synthesis. We also highlight differences in RNA synthesis between filoviruses and two widely studied rhabdoviruses, vesicular stomatitis virus (VSV) of the Vesiculovirus genus and rabies virus (RABV) of the Lyssavirus genus

Forty-Five Years of Marburg Virus Research

viruse

The Australian Bogong Moth Agrotis infusa: A Long-Distance Nocturnal Navigator

The nocturnal Bogong moth (Agrotis infusa) is an iconic and well-known Australian insect that is also a remarkable nocturnal navigator. Like the Monarch butterflies of North America, Bogong moths make a yearly migration over enormous distances, from southern Queensland, western and northwestern New South Wales (NSW) and western Victoria, to the alpine regions of NSW and Victoria. After emerging from their pupae in early spring, adult Bogong moths embark on a long nocturnal journey towards the Australian Alps, a journey that can take many days or even weeks and cover over 1000 km. Once in the Alps (from the end of September), Bogong moths seek out the shelter of selected and isolated high ridge-top caves and rock crevices (typically at elevations above 1800 m). In hundreds of thousands, moths line the interior walls of these cool alpine caves where they “hibernate” over the summer months (referred to as “estivation”). Towards the end of the summer (February and March), the same individuals that arrived months earlier leave the caves and begin their long return trip to their breeding grounds. Once there, moths mate, lay eggs and die. The moths that hatch in the following spring then repeat the migratory cycle afresh. Despite having had no previous experience of the migratory route, these moths find their way to the Alps and locate their estivation caves that are dotted along the high alpine ridges of southeastern Australia. How naïve moths manage this remarkable migratory feat still remains a mystery, although there are many potential sensory cues along the migratory route that moths might rely on during their journey, including visual, olfactory, mechanical and magnetic cues. Here we review our current knowledge of the Bogong moth, including its natural history, its ecology, its cultural importance to the Australian Aborigines and what we understand about the sensory basis of its long-distance nocturnal migration. From this analysis it becomes clear that the Bogong moth represents a new and very promising model organism for understanding the sensory basis of nocturnal migration in insects