Unfavorable environmental conditions: Consequences for microbial metabolism and C stabilization in soil

Bodenbiogeochemische Stoffkreisläufe werden primär durch Bodenmikroorganismen angetrieben, was diese zu einem wichtigen Bindeglied zwischen der Pedo- und der Atmosphäre macht. Bodenmikroben kontrollieren den Kohlenstoff (C)-transfer von terrestrischen Ökosystemen zur Atmosphäre durch die Zersetzung von organischer Bodensubstanz (OBS). Daher haben Bodenmikroben die Macht, das Klima durch die Mineralisierung von C- und Stickstoff (N)-verbindungen zu Treibhausgasen zu „geoingeeren“. Allerdings sind Bodenmikroorganismen häuftig widrigen Bedingungen ausgesetzt, welche entweder natürlich vorkommen oder vom Menschen verursacht werden. Für jeden widrige Bedingung gibt es widerrum Mikroorganismen, welche diese nicht nur tolerieren, sondern sie sogar benötigen um ihre Funktionen auszuführen. Um die Änderungen von Nährstoff- und C-Kreisläufen unter globalem Wandel vorherzusagen ist es daher essenziell, Adaptionsmechanismen, welche es Mikroorganismen erlauben unter widrigen Bedingungen zu überleben und funktionieren, zu verstehen. Positionsspezifische 13C und 14C Markierung und substanzspezifische Analysen wurden als Hauptmethoden angewandt, um mikrobielle Anpassungen an widrigen Bedingungen, sowie die zugrunde liegenden C-Stabilisierungsmechanismen im Boden zu erfassen. Die widrigen Bedingungen waren: 1) Temperaturen unter 0 °C, 2) Respirationsinhibierung durch Giftstoffe, und 3) Nährstofflimitierung durch Sorption an Bodenpartikel. Einbau von 13C oder 14C in CO2, Gesamtboden, mikrobielle Biomasse und Phospholipid-Fettsäuren wurde quantifiziert um mit Hilfe von „metabolic Tracing“ die Adaptionsmechanismen aufzudecken. Temperaturen unter 0 °C induzierten einen Wechsel vom Pentose-Phosphat-Weg (PPP) zu Glycolyse. 13C-Einbau in mikrobielle Biomasse war bei -5 °C 3-fach höher als bei +5 °C, was auf die Synthese interzellulärer Bestandteile wie Glycerol oder Ethanol als Reaktion auf Frost hindeutet. Sogar bei -20 °C wurde nach einem Tag weniger als 0,4% des 13C im gelösten organischen C (DOC) gefunden. Dies demonstriert die komplette Aufnahme von Glukose durch Mikroorganismen. Den 5-fach höheren Gehalt an extra- im Vergleich zum intrazellulären 13C führten wir daher auf ausgeschiedene Frostschutzsubstanzen zurück. Dies legt den Schluss nahe, dass mit sinkender Temperatur interzellulärer von extrazellulärem Frostschutz unterstützt wird um Zellschäden durch kristallisierendes Wasser zu vermeiden. Ein starker Anstieg des Gehalts von einfach ungesättigten Fettsäuren und damit verbundener höherer Einbau von 13C bei -5 °C wurde durch 1) Desaturierung von existierenden Fettsäureketten und 2) Neubildung von PLFA erklärt. Im Gegensatz dazu überwog bei -20 °C der Einbau von 13C in kurzkettige, verzweigte Fettsäuren. Dies zeigt einen Adaptionsmechanismus der mikrobiellen Membranen an Temperaturen unter 0 °C auf. Respirationsinhibierung durch Natriumazid (NaN3) verhinderte den Einbau von 13C in PLFA und verminderte den gesamten CO2-Ausstoß. Der Gehalt von 13C in CO2 war jedoch im Vergleich mit den Kontrollböden um 12% erhöht, da die aufgenommene Glukose verstärkt zur Energieerzeugung benutzt wurde. Die 5-fach höhere 13C-Wiederfindung im Boden im Vergleich zur mikrobiellen Biomasse legt nahe, dass glukosebürtiger C zur Produktion von extrazellulären Substanzen genutzt wurde. Die Produktion von redoxaktiven Substanzen zur extrazellulären Beseitigung von Elektronen würde es den Zellen erlauben, die inhibierten Elektronentransportketten zu umgehen. Der Gehalt an PLFA verdoppelte sich zehn Tage nach der Inhibierung, was eine Erholung der mikrobiellen Gemeinschaft demonstriert. Der beobachtete Wachstum basierte dabei zum Großteil auf dem Recycling von metabolisch teuren Biomassekomponenten, z.B. Alkylketten, von mikrobieller Nekromasse. Das Umgehen von interzellulären Giftstoffen durch den Transport von Elektronen außerhalb der Zellen erlaubt eine schnelle Erhohlung der mikrobiellen Gemeinschaft. Sorption von Alanin verminderte das initiale Mineralisierungsmaximum um ≈80% im Vergleich zu freiem Alanin. Der Einbau von sorbiertem Alanin in die mikrobielle Biomasse war vier Mal höher als von freiem Alanin. Zusätzlich dazu waren C-2 und C-3 von sorbiertem Alanin an Tag 3 noch gleichermaßen im Boden vorhanden, wärend C-2 von freiem Alanin schon deutlich weniger eingebaut war als C-3. Noch deulicher wird der Unterschied zwischen freiem und sorbiertem C-2, wenn mikrobielle Biomasse betrachtet wird. Dies deckt einen verringerten Fluss durch den Zitronensäurezyklus auf. Daher verändert die Nutzung von sorbiertem Substrat die metabolen Wege hin zu einem verstärkeren anabolen Einsatz, womit eine höhere Kohlenstoffnutzungseffizienz (CUE) einher geht. Zusätzlich zu den Änderungen der mikrobiellen Stoffwechselaktivität findet unter widrigen Bedingungen eine Anpassung der mikrobiellen Gemeinschaft statt, um den Verlust von sensitiveren Populationen zu kompensieren. Das Verhätnis von pilzlichen zu bakteriellen PLFA zeigte, dass durch niedrigere Temperaturen und respirationsinhibierende Giftstoffe eine stärkere bakteriell geprägte Gemeinschaft entsteht. Die Nachteile für die pilzlichen Mikroorganismen, welche durch Giftstoffe ausgelöst wurden waren allerdings von kürzerer Dauer als diejenigen der niedrigen Temperaturen. Gegenüber von Giftstoffen scheinen Pilze also eine größere Wiederstandskraft zu besitzen als gegenüber Frost. Änderungen des mikrobiellen Stoffwechsels und der Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen haben auch einen Einfluss auf C-, Energie- und Nährstoffflüsse auf der Ökosystemebene, besonders in Anbetracht der Tatsache, dass gezeigt wurde, dass C aus labilen Quellen wie Zuckern im Boden länger erhalten bleiben kann als Substanzen mit hoher Rekalzitranz wie Lignin. Die Verfolgung von glukose- und ribosebürtigem C unter Langzeitfeldbedingungen zeigte dabei, dass der Persistenz verschiedene Mechanismen zu Grunde liegen können. Die Persistenz von glukosebürtigem C konnte zum Großteil durch Recycling erklärt werden. Im Gegensatz dazu charakterisierte die Stabilisierung in nicht-lebender OBS die Persistenz von ribosebürtigem C. Sogar innerhalb einer Stoffklasse labiler organischer Stoffe – den Monosacchariden – unterscheiden sich also Stabilisierungsmechanismen. Daher wird deutlich, dass die Stabilisierung von C im Boden zum Großteil von metabolen Transformationen abhängt, welche nicht nur von der Substanzklasse und ihren Stoffwechselwegen bedingt wird, sondern auch von den Umweltbedingungen an welche die Mikroorganismen ihren Metabolismus angepasst haben. Für jede untersuchte Bedingung haben Mikroorganismen Toleranz gezeigt, was darauf hindeutet, dass die Grenzen für Leben auf der Erde alles andere als gut definiert sind. Die Kombination von positionsspezifischer Markierung mit substanzspezifischen Analysen deckte die Mechanismen auf, welche es Mikroben erlauben unter widrigen Bedingungen zu überleben und funktionieren. Mikroorganismen verwenden eine Reihe von metabolen und physiologischen Anpassungen, aber auch Änderungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft, als Antwort auf widrige Bedingungen. Die Anpassungen der mikrobiellen Stoffwechselaktivität beeinflust die C-Stabilisierung im Boden. Daher ist das Wissen über diese Anpassungsstrategien und ihre Auswirkungen auf C-Flüsse entscheidend für die Vorhersage von Änderungen der C-Kreisläufe, welche durch verschiedene Ausprägungen des globalen Wandels induziert werden.Soil microorganisms are primary drivers of biogeochemical cycles, making them an important link between pedosphere and atmosphere. Soil microbes control the carbon (C) transfer from terrestrial ecosystem to the atmosphere via the decomposition of soil organic matter (SOM). Thus, soil microbes have the power to geo-engineer the climate through mineralization of C and nitrogen (N) compounds into greenhouse gases. However, soil microorganisms are frequently exposed to unfavorable conditions either naturally or anthropogenically. For every unfavorable condition, some microorganisms have been found to not only tolerate the conditions, but also often require the conditions to perform their functions. Therefore, understanding adaptation mechanisms enabling microorganisms to survive and function under the unfavorable conditions is essential predicting the response of nutrients and C cycle to diverse expressions of global change. Position-specific 13C and 14C labeling and compound-specific analysis were applied as the main methodological approach to study microbial adaptations to unfavorable conditions and mechanisms underlying C stabilization in soil. The unfavorable conditions were: 1) subzero temperatures, 2) respiration inhibition by toxicants, and 3) nutrient limitation induced by sorption in soil. Incorporation of 13C or 14C into CO2, bulk soil, microbial biomass and phospholipid fatty acids (PLFA) was quantified to identify adaptation mechanisms with the aid of metabolic tracing. Subzero temperatures induced a switch from pentose phosphate pathway (PPP) to glycolysis. 13C incorporated into microbial biomass was 3-fold higher at 5 than +5 °C, which points to a synthesis of intracellular compounds such as glycerol and ethanol in response to freezing. Even at 20 °C, less than 0.4% of 13C was recovered in dissolved organic C (DOC) after one day, demonstrating complete glucose uptake by microorganisms. Consequently, we attributed the 5-fold higher extra- than intracellular 13C to secreted antifreeze compounds. This suggests that with decreasing temperature, intracellular antifreeze protection is complemented by extracellular mechanisms to avoid cellular damage by crystallizing water. These mechanisms reflect the general response of microbial groups in soil. To understand the effect of freezing on individual microbial group in soil phospholipid fatty acid (PLFA) analysis was performed. Based on these results, a strong increase of mono-unsaturated fatty acids and corresponding 13C incorporation at -5 °C was attributed to 1) desaturation within existing fatty acid chains, and 2) de novo synthesis of PLFA. On contrary, 13C incorporation into short-chain branched fatty acids was dominant at -20 °C. This reflects adaptation of microbial membranes to subzero temperatures. A part from freezing, microbial activity can be hampared by toxicant exposure due to human activities. Despite exposure, CO2 is persistently released from soils. To determine the origin and understand the mechanism underlying such persistent CO2 release, soil microorganisms were exposed to sodium azide (NaN3) as model toxicant inhibiting respiration. Respiration inhibition prevented 13C incorporation into PLFA and decreased total CO2 release. However, 13C in CO2 increased by 12% compared to control soils due to an increased use of glucose for energy production. The allocation of glucose-derived carbon towards extracellular compounds, demonstrated by a 5-fold higher 13C recovery in bulk soil than in microbial biomass, suggests the synthesis of redox active substances for extracellular disposal of electrons to bypass inhibited electron transport chains within the cells. PLFA content doubled within 10 days of inhibition, demonstrating recovery of the microbial community. This growth was largely based on recycling of metabolically expensive biomass compounds, e.g., alkyl chains, from microbial necromass. The bypass of intracellular toxicity by extracellular electron transport permits the fast recovery of the microbial community. Toxicants are not the only limitation in soils. Soil is full of C; however, this C is not always avilabe because 70-100% is found in close association with organic and mineral fractions in soil. This means that soil microorganism suffer starvation induced by nutrient sorption in soil. To identify metabolic adaptations of soil microbes to nutrient limitation induced by sorption, we tracked transformation of sorbed alanine. Sorption of alanine decreased the initial mineralization peak by ≈80% compared to free alanine. Consequently, a 4-fold incorporation of 14C into microbial biomass was induced by sorption. Additionally, C-2 and C-3 of sorbed alanine remained in equal proportion in soil until day 3 contrary to free alanine in which significantly lower C-2 was incorporated than C-3. Even more vivid, an increased incorporation of C-2 into microbial biomass under sorption reveals a decrease of C flux through the citric acid cycle. Therefore, use of sorbed substrate shifts microbial metabolism towards a higher C use in anabolism, resulting in increased carbon use efficiency (CUE). In addition to changes in microbial metabolic activity, shift in microbial community structure to compensate for the loss of more sensitive populations also occurs under unfavorable conditions. The fungal/bacterial PLFA ratio revealed a shift towards bacteria at subzero temperatures and in presence of respiration inhibiting toxicants. However, susceptibility of fungal populations to toxicant was short-lived compared to subzero temperatures. This suggests that fungi are more resilient to toxicants than perturbations imposed by freezing. Changes in microbial metabolic activity and community structure due to changes in environmental conditions also influence ecosystem-level C, energy and nutrient flows, especially considering that C derived from labile compounds such as sugars have been shown to persist longer in soil than those from compounds of high recalcitrance such as lignin. Tracking glucose and ribose-derived C under long-term field conditions revealed that different mechanisms underlie their persistence. The persistence of glucose-derived C was mainly dominated by recycling. On contrary, stabilization in non-living SOM characterized the persistence of ribose-derived C. Therefore, even with the same class of labile compounds – the monosaccharides, the mechanisms responsible for C stabilization differ. Thus, stabilization of C in soil is largely influenced by metabolic transformation of the compound – affected not only by the compound class and its metabolic pathway, but also by the environmental conditions to which the microorganism is adapting its metabolism. Thus, for every condition investigated, some microorganisms have shown tolerance, implying that the limit of life on Earth is far from being well defined. Combining positions-specific labelling with compound-specific analysis revealed such mechanisms allowing microbes to survive and function under unfavorable conditions. Microorganisms induce a suite of not only metabolic and physiological changes, but also shifts in microbial community structure in response to unfavorable conditions. The changes in microbial metabolic activity influences C stabilization in soil. Knowledge on these adaptation strategies and their implications for C fluxes in crucial in predicting changes in C cycles induced by various phenomena of global change

Microbial Metabolism in Soil at Subzero Temperatures: Adaptation Mechanisms Revealed by Position-Specific 13C Labeling

Although biogeochemical models designed to simulate carbon (C) and nitrogen (N) dynamics in high-latitude ecosystems incorporate extracellular parameters, molecular and biochemical adaptations of microorganisms to freezing remain unclear. This knowledge gap hampers estimations of the C balance and ecosystem feedback in high-latitude regions. To analyze microbial metabolism at subzero temperatures, soils were incubated with isotopomers of position-specifically 13C-labeled glucose at three temperatures: +5 (control), -5, and -20°C. 13C was quantified in CO2, bulk soil, microbial biomass, and dissolved organic carbon (DOC) after 1, 3, and 10 days and also after 30 days for samples at -20°C. Compared to +5°C, CO2 decreased 3- and 10-fold at -5 and -20°C, respectively. High 13C recovery in CO2 from the C-1 position indicates dominance of the pentose phosphate pathway at +5°C. In contrast, increased oxidation of the C-4 position at subzero temperatures implies a switch to glycolysis. A threefold higher 13C recovery in microbial biomass at -5 than +5°C points to synthesis of intracellular compounds such as glycerol and ethanol in response to freezing. Less than 0.4% of 13C was recovered in DOC after 1 day, demonstrating complete glucose uptake by microorganisms even at -20°C. Consequently, we attribute the fivefold higher extracellular 13C in soil than in microbial biomass to secreted antifreeze compounds. This suggests that with decreasing temperature, intracellular antifreeze protection is complemented by extracellular mechanisms to avoid cellular damage by crystallizing water. The knowledge of sustained metabolism at subzero temperatures will not only be useful for modeling global C dynamics in ecosystems with periodically or permanently frozen soils, but will also be important in understanding and controlling the adaptive mechanisms of food spoilage organisms