To be helped or not helped, that is the question

Diphtheria toxin (DT)* is the paradigm of the powerful A-B toxins. These bacterial poisons bind to cells, are endocytosed, and inject their catalytic domain into the cytosol causing the irreversible modification of a key component of the the host cellular machinery. The mechanism by which the hydrophilic enzymatic fragment of DT crosses the endosomal membrane and is released into the cytosol remains controversial. In this issue, Ratts et al. (2003) demonstrate that delivery of the DT catalytic domain from the lumen of purified early endosomes to the external medium requires the addition of a cytosolic translocation factor complex composed in part of Hsp90 and thioredoxin reductase

Escherichia coli Cytotoxic Necrotizing Factor 1 (CNF1), a Toxin That Activates the Rho GTPase

Cytotoxic necrotizing factor 1 (CNF1), a 110-kDa protein toxin from pathogenic Escherichia coli induces actin reorganization into stress fibers and retraction fibers in human epithelial cultured cells allowing them to spread. CNF1 is acting in the cytosol since microinjection of the toxin into HEp-2 cells mimics the effects of the externally applied CNF1. Incubation in vitro of CNF1 with recombinant small GTPases induces a modification of Rho (but not of Rac, Cdc42, Ras, or Rab6) as demonstrated by a discrete increase in the apparent molecular weight of the molecule. Preincubation of cells with CNF1 impairs the cytotoxic effects of Clostridium difficile toxin B, which inactivates Rho but not those of Clostridium sordellii LT toxin, which inhibits Ras and Rac. As shown for Rho-GTP, CNF1 activates, in a time- and dose-dependent manner, a cytoskeleton-associated phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase. However, neither the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) nor the phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate (PI 3,4-P2) or 3,4,5-trisphosphate (PIP3) cellular content were found increased in CNF1 treated HEp-2 cells. Cellular effects of CNF1 were not blocked by LY294002, a stable inhibitor of the phosphoinositide 3-kinase. Incubation of HEp-2 cells with CNF1 induces relocalization of myosin 2 in stress fibers but not in retraction fibers. Altogether, our data indicate that CNF1 is a toxin that selectively activates the Rho GTP-binding protein, thus inducing contractility and cell spreading

Helicobacter pylori Counteracts the Apoptotic Action of Its VacA Toxin by Injecting the CagA Protein into Gastric Epithelial Cells

Infection with Helicobacter pylori is responsible for gastritis and gastroduodenal ulcers but is also a high risk factor for the development of gastric adenocarcinoma and lymphoma. The most pathogenic H. pylori strains (i.e., the so-called type I strains) associate the CagA virulence protein with an active VacA cytotoxin but the rationale for this association is unknown. CagA, directly injected by the bacterium into colonized epithelium via a type IV secretion system, leads to cellular morphological, anti-apoptotic and proinflammatory effects responsible in the long-term (years or decades) for ulcer and cancer. VacA, via pinocytosis and intracellular trafficking, induces epithelial cell apoptosis and vacuolation. Using human gastric epithelial cells in culture transfected with cDNA encoding for either the wild-type 38 kDa C-terminal signaling domain of CagA or its non-tyrosine-phosphorylatable mutant form, we found that, depending on tyrosine-phosphorylation by host kinases, CagA inhibited VacA-induced apoptosis by two complementary mechanisms. Tyrosine-phosphorylated CagA prevented pinocytosed VacA to reach its target intracellular compartments. Unphosphorylated CagA triggered an anti-apoptotic activity blocking VacA-induced apoptosis at the mitochondrial level without affecting the intracellular trafficking of the toxin. Assaying the level of apoptosis of gastric epithelial cells infected with wild-type CagA+/VacA+ H. pylori or isogenic mutants lacking of either CagA or VacA, we confirmed the results obtained in cells transfected with the CagA C-ter constructions showing that CagA antagonizes VacA-induced apoptosis. VacA toxin plays a role during H. pylori stomach colonization. However, once bacteria have colonized the gastric niche, the apoptotic action of VacA might be detrimental for the survival of H. pylori adherent to the mucosa. CagA association with VacA is thus a novel, highly ingenious microbial strategy to locally protect its ecological niche against a bacterial virulence factor, with however detrimental consequences for the human host

Sensibilité aux antibiotiques des biofilms de souches de pseudomonas aeruginosa isolées de patients atteints de mucoviscidose

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Endocytose et trafic intracellulaire de la cytotoxine VacA d'Helicobacter pylori

La cytotoxine VacA est un facteur de virulence sécrété par Helicobacter pylori associé à l'effet carcinogène de la bactérie. Des travaux rapportent d'une part un mode d'action probable de VacA par formation d'un canal dans la membrane plasmique des cellules, d'autre part, que la suppression des protéines à ancre GPI et la dépolymérisation de l'actine bloquent la vacuolisation des cellules induite par la toxine. Dans un première partie, nous montrons que les pGPIs sont requises par VacA pour former un canal chlorure pleinement fonctionnel dans la membrane plasmique des cellules, en préambule à son endocytose, dépendante de l'actine. Nos études montrent aussi que l'endocytose du canal augmente la sensibilité des endosomes tardifs à accumuler les bases faibles en modulant l'homéostasie chlorhydrique de ces compartiments. Dans une seconde partie, nous montrons que VacA entre dans les cellules par un nouveau compartiment précoce d'endocytose, le GEEC pour " GPI-anchored proteins enriched early endosomal compartment ". Cette endocytose dépend exclusivement de la petire GTPase Rac1 et est indépendante de la cavéoline. Dans une dernière partie, nous montrons que les endosomes précoces contenant VacA sont associés avec des comètes d'actines. Ces comètes semblent nécessaire au transfert de VacA des endosomes précosses aux endosomes tardifs. L'ensemble de ces deux derniers travaux montrent que la cytotoxine VacA définit une nouvelle voie d'endocytose pour les toxines bactériennes. De plus, ces résultats rapportent pour la première fois un rôle de l'actine dans les mécanismes de transfert entre les endosomes précoces et endosomes tardifs par un astucieux système de comètes intracellulaires.The Helicobacter Pylori VacA cytotoxin is a major virulence factor associated with the carcinogenic effects of the bacteria. It has been previously shown that VacA is a pore forming toxin. The suppression of the GPI-anchored proteins and the actin cytoskeleton depolymerization prevent the toxin to induce the vacuolation of the late endocytic compartments. In the first part of this study, we show that formation of functional VacA channels at the cell surface requires GPI-anchored proteins and also that endocytosis of these channels, by an actin-dependent process, increases the chloride content of the late endosomes. In turn, late endosomes accumulate weak bases and are enlarged by osmotic swelling. In a second part, we describe that VacA defines a new early endocytic compartment named GPI-anchored proteins-enriched early endosomal compartment (GEEC). VacA internalization relies on an actin-driven process of endocytosis that was modulated by Rac1 and that was independent of the caveolin 1. In a last part, we show that early endosomes containing VacA are associated with actin comet tails which seem to be necessary for toxin transfer from the early to late endosomes. The two latter studies show that VacA defines a novel endocytic pathway for bacterial toxins. These results provide in addition original evidence for the existence of actin transfer mechanisms between early and late endosomes.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Intérêt du dosage urinaire de l'interleukine 8 dans le diagnostic des infections du tractus urinaire (thèse)

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Sepsis sévère et choc septique (influence de l'haplogroupe mitochondrial H sur la genèse du stress oxydant)

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Etude de l'expression de CNF1 dans la souche uropathogène Escherichia coli J96 et de son export à travers les membranes bactériennes

Bien que le mode d'action moléculaire de la toxine CNF1 soit relativement bien connu, son rôle en pathologie infectieuse reste mal défini. Cette toxine est produite par environ un tiers des souches E. coli uropathogènes (UPEC) quel que soit le contexte clinique de l'infection. Dans l'urine, contrairement à ce qui avait été observé dans les milieux de culture classiques, le CNF1 est retrouvé à l'extérieur de la bactérie. Nous avons voulu étudier son mode de transport à travers les membranes bactériennes. Nous avons pu démontrer le transfert passif de CNF1 à travers la membrane externe à la faveur d'une perturbation de la stabilité de cette dernière. Après avoir exclu l'utilisation d'une machinerie spécifique de sécrétion, nous avons démontré que le CNF1 pouvait franchir la membrane interne d'E. coli, sous forme non structurée, exposant alors deux hélices hydrophobes. Nous savons que la production de la toxine est régulée au niveau post-transcriptionnel du fait de la présence d'une séquence complémentaire du site de liaison du ribosome dans la partie 5' codante de cnf1, permettant un phénomène de "fold back inhibition",(fbi). Le gène cnf1 est constamment associé à l'opéron hly codant pour l'hémolysine alpha d'E. coli et placé en amont. La région (igs) séparant ces deux gènes est conservée. Nous avons pu démontrer que la transcription d'un ARN messager contenant l'ensemble de l'opéron hly, l'igs et cnf1, dépendante à l'action régulatrice sur hly de l'anti-terminateur RfaH, entraîne une inhibition de l'effet fbi sur l'expression de CNF1. Nous insistons sur l'importance de la co-transcription des toxines HlyA et CNF1, en faisant l'hypothèse que le complexe de transcription dépendant de l'activation de RfaH puisse être spécifiquement dirigé au niveau des membranes pour être traduit. Nous évoquons finalement une éventuelle coordination des deux toxines dans la physiopathologie de l'infection urinaire d'autant que le CNF1 est capable de passer dans l'urine.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Endocytose et trafic intracellulaire de la toxine CNF1 activatrice des Rho-GTPases

Le facteur cytotoxique nécrosant 1 (CNF1) d'Escherichia coli est une toxine de type AB qui active les GTPases de la famille Rho. CNF1 a une structure tripartite, regroupant trois domaines fonctionnels, chacun étant responsable d'une étape du processus d'intoxication. Le domaine amino-terminal de la toxine est responsable de sa fixation avec une haute affinité à une protéine intégrale de membrane de 85 kDa relativement abondante (50 000 récepteurs par cellule HEp-2). Le complexe toxine-récepteur est internalisé d'une façon similaire à la toxine du ricin qui emprunte plusieurs voies d'endocytose différentes (voie dépendante de la clathrine et voies indépendantes). Le complexe toxine-récepteur suit la voie de dégradation et traverse successivement le compartiment endosomal précoce puis tardif. Comme DT, CNF1 transloque son activité catalytique sous l'effet du pH acide de l'endosome. Cependant, alors que DT transloque son activité catalytique dans la membrane de l'endosome précoce, CNF1 doit rejoindre le compartiment endosomal tardif pour transloquer son activité catalytique. Une fois dans le cytoplasme, le domaine catalytique active les protéines Rho impliquées notamment dans la régulation du cytosquelette d'actine, induisant la formation de fibres de tension (voie dépendante de Rho), de lamellipodes (voie dépendante de Rac) et de filopodes (voie dépendante de Cdc42).NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF