Consensus mutagenesis reveals that non-helical regions influence thermal stability of horseradish peroxidase

The enzyme horseradish peroxidase has many uses in biotechnology but a stabilized derivative would have even wider applicability. To enhance thermal stability, we applied consensus mutagenesis (used successfully with other proteins) to recombinant horseradish peroxidase and generated five single-site mutants. Unexpectedly, these mutations had greater effects on steady-state kinetics than on thermal stability. Only two mutants (T102A, T110V) marginally exceeded the wild type's thermal stability (4% and 10% gain in half-life at 50 °C respectively); the others (Q106R, Q107D, I180F) were less stable than wild type. Stability of a five-fold combination mutant matched that of Q106R, the least-stable single mutant. These results were perplexing: the Class III plant peroxidases display wide differences in thermal stability, yet the consensus mutations failed to reflect these natural variations. We examined the sequence content of Class III peroxidases to determine if there are identifiable molecular reasons for the stability differences observed. Bioinformatic analysis validated our choice of sites and mutations and generated an archetypal peroxidase sequence for comparison with extant sequences. It seems that both genetic variation and differences in protein stability are confined to non-helical regions due to the presence of a highly conserved alpha-helical structural scaffold in these enzymes

Inferring eco-evolutionary feedbacks from time series data using neural ordinary differential equations

Ecological and evolutionary dynamics were thought to operate on different time scales. Recent evidence showed that evolution could be rapid enough to interplay with ecological dynamics and form eco-evolutionary feedbacks. These feedbacks are hard to identify in nature, due to the complexity of the mechanisms and the difficulty of obtaining phenotypic, demographic, and environmental variables. We lack quantitative evidence on feedback effects in real systems, which prevents us from painting a complete view of feedback architectures. We develop a mathematical framework, neural ordinary differential equations (NODEs), to quantify feedbacks from time series data of the evolutionary, ecological, and environmental variables in the system. The framework combines ordinary differential equations and artificial neural networks, to identify, non-parametrically, drivers of evolutionary and ecological dynamics, and relies on the Geber method to recover the contribution of ecological change to evolution, and vice versa. We apply the technique to recover the coupling between the dynamics of three species in a prey-predator system. We find that main interactions, between the prey and top predator are conserved across replicates, while weaker interactions, between the intermediate predator and the other species, are not. We also apply the technique to recover eco-evolutionary feedbacks in two of Darwin’s finches species. We find that feedbacks involve a direct coupling between population dynamics and phenotypic change in only one of the species, while the other involves a coupling with resource levels. Our work demonstrates the potential of NODEs in uncovering drivers of dynamics in systems where prior mechanistic knowledge is lacking, and shows the importance of indirect effects in driving eco-evolutionary feedbacks in nature

Dictionnaire des amateurs français au XVIIe siècle

Includes bibliographical references.Mode of access: Internet

Préparation et oligomérisation d'une brique trisaccharidique issue de ressources renouvelables (vers la simplification d'un inhibiteur d'entrée du VIH ?)

Ce travail de thèse a pour objectif la simplification de la préparation d un nouveau type d inhibiteur d entrée du VIH conçu, synthétisé et validé dans le cadre d une collaboration entre l équipe de Glycochimie Moléculaire et Macromoléculaire dont je dépends, l Institut de Biologie Structurale de Grenoble et l Institut Pasteur de Paris. Ce prototype est constitué d un mime fonctionnel de CD4 lié de façon covalente à un fragment dodécasaccharidique d Héparane Sulfate dont la synthèse est complexe. Nous avons donc proposé de préparer des oligomaltosides sulfatés afin de déterminer s ils pouvaient se comporter comme des mimes d Héparane Sulfate.Dans un premier temps, nous avons mis au point la synthèse, en huit étapes et 38 % de rendement global, d un précurseur trisaccharidique oligomérisable à partir de maltotriose, un trisaccharide biosourcé commercial. Au cours de ce travail, nous avons résolu trois points particulièrement délicats : l allylation de l extrémité réductrice du maltotriose, l installation d un groupement paraméthoxybenzylidène en position O-4III et O-6III et la protection sélective des positions O-6I et O-6II par un groupement silylé. Les optimisations menées nous ont permis de limiter la formation de produits secondaires, d augmenter le rendement de chaque étape et de pouvoir mener sans problème cette synthèse sur une échelle d une dizaine de grammes. Dans un deuxième temps, le précurseur trisaccharidique a été transformé en différents accepteurs et donneurs de glycosyle dont les comportements dans différentes conditions de glycosylation ont été étudiés. Nous avons ainsi pu démontrer qu une activation des donneurs sous forme de trichloroacetimidate conduisait à des rendements faibles de part la formation d une quantité importante des produits de réarrangement en trichloroacétamides anomériques. Une activation sous forme de N-Phényltrifluroacétimidate a permis de résoudre ce problème, sans toutefois que les rendements en soient toujours augmentés. En effet, nous avons pu montrer que la nature du groupement protecteur en O-6I du donneur a une influence déterminante sur l issue de la réaction de glycosylation, tant au niveau de sa stéréosélectivité que de son rendement. Un groupement encombré ou un ester en O-6I du donneur est ainsi indispensable pour avoir une bonne stéréosélectivité alpha. Le meilleur rendement obtenu est, pour le moment, de 56 %. Des optimisations en cours permettront d augmenter le rendement et de préparer les oligomaltosides sulfatés visés dans un avenir proche afin de tester leur activité biologique.This work aims at simplifying the preparation of a new type of HIV entry inhibitor, conceived, synthesized and validated within a collaboration between our group, the "Institut de Biologie Structurale" (Grenoble) and the Institut Pasteur (Paris). This prototype is composed of a CD4 functional mimetic linked to a dodecasaccharide fragment of Heparan Sulfate, whose synthesis is complex. In order to determine if Heparan Sulfate may be replaced by simpler sulfated oligosaccharides, we decided to prepare a set of sulfated oligomaltosides.To this goal, we first optimized the synthesis of an oligomerizable maltotrioside building block in eight steps and 38% global yield from maltotriose, a commercial and biosourced trisaccharide. In this work, we had to address three major points: the allylation of the reducing end of maltotriose, the introduction of a paramethoxybenzylidene group between positions O-4III and O-6III and the selective protection of the remaining primary positions O-6I and O-6II by a silylated protecting group. Each step has been optimized to minimize the amount of secondary products and thus to enhance its yield. The resulting synthesis was thus shown to be highly reproducible up to ten grams scale.Then, glycoside acceptors and donors were prepared from the oligomerizable maltotrioside building block and we studied their behaviors in glycosylation reactions. We found that trichloroacetimidate activation led to poor glycosylation yields, due to the competitive formation of trichloroacetamidyl glycoside rearrangement product. Gratifyingly, N-phenyltrifluroacetimidate activation solved the rearrangement problem, but yields sometimes remained low. Indeed, we were able to demonstrate that the nature of the protecting group in position O-6I of the donor strongly influenced both the stereoselectivities and yields of the glycosylations: a bulky or ester group is needed in this position to obtain a full alpha stereoselecticity. To date, the highest yield obtained is 56 %.Ongoing optimizations will allow us to enhance the yields and to prepare the targeted sulfated oligomaltosides in a near future in order to test their biological activity.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Protections régiosélectives pour l'optimisation moléculaire d'un glycoconjugué anti-interféron gamma

Les Héparane Sulfate (HS) interagissent avec de nombreuses protéines et notamment avec l interféron gamma (IFN- , une cytokine impliquée dans bon nombre de pathologies inflammatoires et auto-immunes. Le composé 2O10, un glycoconjugué synthétique d HS, possède une très forte activité de liaison à l IFN- et montre une capacité unique à inhiber à la fois les interactions IFN- / Récepteur IFN- et les interactions IFN- / HS. Ce travail de thèse a consisté à mettre au point une méthode d accès très convergente à une série de disaccharides D-Glucuroniques non disponibles jusqu alors, et nécessaires à l optimisation moléculaire de 2O10 dans le but d augmenter son activité et sa spécificité pour l IFN- Cette voie de synthèse a nécessités la mise au point de réactions régiosélectives clés, principalement d acétylation et de benzylation via l utilisation de la réaction d éthérification réductrice, méthode dont le développement est actuellement en plein essor.L optimisation de toutes ces réactions régiosélectives a permis d établir des protocoles "one-pot" efficaces pour la synthèse de trois des composés désirés (rendements compris entre 61 % et 75 %) à partir d un unique précurseur disaccharidique facilement accessible. Ces protocoles, appliqués à des disaccharides, présentent des rendements similaires à ceux décrits dans la littérature sur des monosaccharides. Les rendements obtenus rendent donc nos protocoles "one-pot" particulièrement attractifs.Heparane Sulfate (HS) interact with numerous proteins, in particular with interferon gamma (IFN- , a cytokine involved in a lot of inflammatory and auto-immune diseases. The compound 2O10, an HS synthetic glycoconjugate, has shown an unique ability to inhibit both interactions between IFN- / IFN- Receptor and IFN- / HS. This work focuses on the elaboration of an highly convergent synthesis of D-Glucuronic disaccharides which are necessary for the molecular optimization of 2O10 in order to enhance its affinity and specificity for IFN- This synthesis required the development of efficient regioselective reactions, mainly acetylation and benzylation via the use of reductive etherification, a method currently rapidly expanding.The optimization of all these regioselective reactions allowed establishing effective "one-pot" protocols for the synthesis of three disaccharides (yields between 61 % and 75 %) from a single easily accessible disaccharide precursor. These procedures, applied to disaccharides, present similar yields to those described in the literature for monosaccharides. The obtained yields thus make our "one-pot" protocols particularly attractive.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Glycosylation 1,2-cis (nouveaux intermédiaires réactionnels pour moduler la stéréosélectivité)

Les héparanes sulfates sont des polysaccharides linéaires et sulfatés interagissant et régulant l activité de nombreuses protéines, en particulier les cytokines et chimiokines, messagers du système immunitaire. Ils sont à ce titre de bons candidats médicaments dans des pathologies inflammatoires, autoimmunes, d immunodéficience acquise ou encore en oncologie. La finalité de cette thèse a été de développer de nouvelles méthodologies nécessaires à la préparation de fragments d héparane sulfate. Nous nous sommes particulièrement intéressés à améliorer la stéréosélectivité alpha et le rendement réactionnel des réactions de couplage glycosidique en position 4 d un accepteur glucuronique impliquant un donneur de type 2-azido glycoside avant de pouvoir aborder par la suite une synthèse en mélange. Cette optimisation a consisté à substituer le groupement partant trichloroacétimidate, employé jusqu à présent au laboratoire, par un groupement thiophényle activé par le système promoteur PhSOR/Tf2O à basse température. Cette méthode permet de générer in situ un intermédiaire triflate. Une fois ce dernier engendré, un additif de type XR2 (où X = N, O, S) a été additionné au mélange réactionnel avant d ajouter en dernier lieu l accepteur. Une étude préliminaire de ce mode opératoire réalisée sur des monosaccharides rapidement synthétisables a conduit à des résultats encourageants, cette méthode de glycosylation en trois temps a donc été appliquée à la synthèse de tétrasaccharides. Comparativement à l ancienne méthode employant un groupement trichloroacétimidate, le rendement ainsi que la sélectivité alpha ont a été significativement améliorés lorsque l additif employé a été le THF.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Combinatorial surfaces mimicking heparan sulfate biological activities: unexpected application to new electronic tongue devices

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