Polyurea dendrimer for efficient cytosolic siRNA delivery

PEst-OE/SAU/UI0009/2013 SFRH/BD/62957/2009The design of small interfering RNA (siRNA) delivery materials showing efficacy in vivo is at the forefront of nanotherapeutics research. Polyurea (PURE-type) dendrimers are 'smart' biocompatible 3D polymers that unveil a dynamic and elegant back-folding mechanism involving hydrogen bonding between primary amines at the surface and tertiary amines and ureas at the core. Similarly, to a biological proton pump, they are able to automatically and reversibly transform their conformation in response to pH stimulus. Here, we show that PURE-G4 is a useful gene silencing platform showing no cellular toxicity. As a proof of concept we investigated the PURE-G4-siRNA dendriplex, which was shown to be an attractive platform with high transfection efficacy. The simplicity associated with the complexation of siRNA with polyurea dendrimers makes them a powerful tool for efficient cytosolic siRNA delivery.authorsversionpublishe

Pós-colheita do mamão (Carica papaya L.): limite máximo de resíduos de etilenobisditiocarbamatos (EBDCs).

O Brasil é responsável por 25% da produção mundial de mamão (Carica papaya L.), o que equivale a 1,6 milhão de tonelada/ano. Os estados da Bahia e do Espírito Santo destacam-se com 860.000 e 420.500 toneladas/ano, respectivamente. A União Européia é o principal mercado consumidor, para onde exportamos cerca de 70% da nossa produção. No entanto, parte dessas exportações têm sido rechaçadas, na Comunidade Européia, devido a resíduos não conformes de etilenobis(ditiocarbamatos) (EBDCs) nos frutos, conforme registros do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Legalmente os níveis de resíduos de pesticidas são controlados pelos limites máximos de resíduos (LMRs) que são estabelecidos para um par pesticida/cultura, e podem ser inexistentes ou diferentes em diversos países. Quando a cultura não é característica de um determinado país, ensaios de campo para estabelecimento de LMRs não são possíveis de ser efetuados, portanto, não se consegue estabelecer limites dos resíduos de fungicidas ditiocarbamatos na União Européia. Assim, adota-se a prática da tolerância zero que, normalmente é estabelecida no limite de quantificação do método analítico (sem a interferência de matrizes). Por exemplo, na Comunidade Européia, o LMR para EBDCs em mamão é o limite de determinação do método (0,05mg kg-1). O mamoeiro é muito sensível às variações climáticas e ambientais, e por isso é bastante suscetível a várias doenças, demandando rigoroso controle fitossanitário em todas as fases fenológicas da cultura. Certas doenças fúngicas promovem a podridão terminal do caule, do pedúnculo e dos frutos durante o amadurecimento e/ou armazenamento, entre elas, a pinta preta (Asperisporium caricae) é uma doença muito comum, que apesar de não causar grandes perdas em produtividade, como outras podridões, resulta na desvalorização do produto. Das doenças de pós-colheita, a antracnose (Colletotrichum gloeosporioides), é a principal, podendo ser responsável por até 40% da perda dos frutos. O controle dessas doenças é feito de forma preventiva com aplicações no campo de fungicidas sendo o mancozebe o mais utilizado. Porém, o mancozebe é um produto com características físicoquímicas que não permitem a análise direta de seus resíduos. Sua determinação é feita de forma indireta pela quantificação de dissulfeto de carbono (CS2) gerado numa hidrólise ácida. O problema associado à análise indireta é a geração endógena de CS2. Esse fato é conhecido na família das brássicas e nas caricáceas foi demonstrado nas variedades Golden, Sunrise solo e Tainung cultivadas sem utilização de agroquímicos sulfurados níveis endógenos variando entre <0,02 até 0,34 mg kg-1. No entanto, o enxofre é um elemento essencial para o crescimento das plantas e sua deficiência causa o amarelecimento das folhas sendo que no mamoeiro o crescimento é prejudicado antes da manifestação visual desse sintoma. Em situação real de cultivo, o suprimento de enxofre é efetuado com fertilizantes na forma de sulfato. Um outro produto muito utilizado nesse cultivo é a calda sulfocálcica, um polissulfeto de cálcio, para o controle de insetos. Assim, o objetivo deste estudo foi comparar a concentração endógena de CS2 com aquelas de aplicação em campo de mancozebe, calda sulfocálcica e sulfato de amônio. Além disso, pretendeu-se estabelecer um valor de concentração de CS2 capaz de descriminar os resíduos verdadeiros dos níveis endógenos de CS2

Resíduos de EBDCs e culturas com geração fitogênica de CS2.

A análise de resíduos etilenobis(ditiocarbamatos) (EBDCs) é realizada de maneira indireta, pela dosagem de CS2. Desse modo, plantas que geram fitogenicamente CS2, como as Caricaceas, podem fornecer resultados falso positivos. Todos os métodos de análise de resíduos de EBDCs são uma variação do método de Keppel (1969; 1971), que dosa o CS2 colorimetricamente. O CS2 também pode ser analisado por cromatografia gasosa, utilizando-se a técnica de análise por headspace, ou pela modificação desse método com a dissolução do CS2 em uma camada de solvente orgânico (iso-octano). O objetivo deste estudo foi analisar em amostras testemunha de mamão o nível de CS2 endógeno por três métodos distintos de análise de resíduos de EBDCs: iso-octano, headspace e espectrofotométrico. As concentrações de CS2 foram comparadas com o limite máximo de resíduos adotado pela União Européia (0,05 mg kg-1)

Tolerância para resíduos de EBDCs em culturas com geração fitogênica de CS2.

Neste trabalho foram utilizados três métodos para análise de ditiocarbamatos em amostras testemunha de mamão das variedades Golden, Sunrise solo e Tainung. Os mamões foram cultivados em áreas experimentais sem utilização, durante todo o ciclo da cultura, de agrotóxicos ou fertilizantes sulfurados. O CS2 foi quantificado por espectrofotometria e por cromatografia gasosa utilizando detector fotométrico de chama no modo enxofre, tanto no método por headspace quanto por partição em iso-octano. Todos os métodos forneceram resultados positivos de CS2 no mamão, independentemente da variedade avaliada. As concentrações de CS2 observadas foram comparadas com o limite máximo de resíduos de etilenobis(ditiocarbamatos)(EBDCs), estabelecido na Comunidade Européia em 0,05mg kg-1. A probabilidade de ser encontrada uma amostra de mamão com concentração de CS2 igual ou acima de 0,05 mg kg-1 foi de 12 % pelo método de iso-octano, 55% pelo método de headspace e 94 % pelo método espectrofotométrico. Desse modo, os resíduos de EBDCs quantificados como CS2, devem ser cuidadosamente interpretados em culturas com geração fitogênica de CS2, pois a presença deste não confirma a utilização de fungicidas EBDCs

A análise de etilenotiouréia em mamão evita resultados falso positivos de resíduos de etileno(bis)ditiocarbamatos.

O principal produto de degradação de etileno(bisditiocarbamatos) (EBDCs) é a etilenotiouréia (ETU), que teoricamente pode estar presente em qualquer cultura tratada com esses fungicidas. A formação endógena de CS2 na família das Caricaceas é um fato comprovado e tem conduzido à conclusão errônea da presença de resíduos de EBDCs. Portanto, é necessário estabelecer um procedimento confirmatório para confirmar a presença desses resíduos, sendo uma possibilidade a determinação dos resíduos do seu metabólito ETU. O objetivo deste trabalho foi determinar os resíduos de ETU e de EBDCs em frutos de mamoeiro que receberam tratamento em campo com o fungicida mancozeb

Resíduos de mancozebe e etu em mamão: efeito do tratamento hidrotérmico pós-colheita.

O mancozebe é um fungicida não sistêmico, e seus resíduos devem ser diferentes em frutos que recebam ou não o tratamento hidrotérmico, por sua remoção da superfície dos frutos. Por outro lado uma das preocupações quanto à sua toxicologia é a formação de um produto de transformação, favorecido pela temperatura, a etilenotiouréia (ETU). A ETU é estável em água e é rapidamente absorvida e metabolizada pelas plantas mas, não é estável quando exposta a matrizes de produtos agrícolas. Os seus resíduos são estabelecidos em 50 µg kg-1 (50ppb) pela União Européia. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento hidrotérmico nos resíduos de mancozebe e de ETU em mamão após aplicações sucessivas de mancozebe

Falso positivo na análise de resíduos de etilenobis (ditiocarbamato) em Carica papaya.

Introdução Os métodos que determinam resíduos de ditiocarbamatos são indiretos e fundamentam-se na quantificação do dissulfeto de carbono (CS2), gerado na hidrólise ácida da amostra bruta. Isto porque os ditiocarbamatos além de apresentarem baixa solubilidade nos solventes comumente utilizados nas extrações de pesticidas são também instáveis durante a homogeneização e manuseio das amostras (Cicotti, 2003). Um dos principais problemas encontrados com essas determinações de resíduos de ditiocarbamatos é quando existe a ocorrência fitogênica de CS2 nas culturas analisadas. Este fato é conhecido para a família das Brassicaceas, onde os valores fitogênicos de CS2 podem equiparar - se aos Limites Máximos de Resíduos (Perz et al., 2000). A geração fitogênica de CS2 e de outros compostos voláteis de enxofre tais como sulfeto de carbonila e ácido sulfídrico é um processo que parece estar relacionado com a degradação de isotiocianatos naturais provenientes, por sua vez, da degradação enzimática dos diferentes glicosinolatos encontrados nas dicotiledôneas. Atualmente é conhecido que o sistema mirosinase/glicosinolato ocorre em pelo menos 16 famílias de plantas incluindo as Caricaceaes (Rodman, 1991). Na família das Caricaceaes o benzilglicosinolato pode ser encontrado em todas as partes da planta, como também o metil-tiocianato e benzil-isotiocianato. Desse modo os resíduos de ditiocarbamatos obtidos por hidrólise ácida devem ser cuidadosamente interpretados em função das espécies analisadas. O objetivo deste trabalho foi estabelecer a faixa de concentração de CS2 fitogênico em Carica papaya L. variedade Golden cultivado sem qualquer exposição a agroquímicos sulfurados

Falso positivo na análise de resíduos de Etilenobis (Ditiocarbamato) em Carica papaya.

Introdução Os métodos que determinam resíduos de ditiocarbamatos são indiretos e fundamentam-se na quantificação do dissulfeto de carbono (CS2), gerado na hidrólise ácida da amostra bruta. Isto porque os ditiocarbamatos além de apresentarem baixa solubilidade nos solventes comumente utilizados nas extrações de pesticidas são também instáveis durante a homogeneização e manuseio das amostras (Cicotti, 2003). Um dos principais problemas encontrados com essas determinações de resíduos de ditiocarbamatos é quando existe a ocorrência fitogênica de CS2 nas culturas analisadas. Este fato é conhecido para a família das Brassicaceas, onde os valores fitogênicos de CS2 podem equiparar - se aos Limites Máximos de Resíduos (Perz et al., 2000). A geração fitogênica de CS2 e de outros compostos voláteis de enxofre tais como sulfeto de carbonila e ácido sulfídrico é um processo que parece estar relacionado com a degradação de isotiocianatos naturais provenientes, por sua vez, da degradação enzimática dos diferentes glicosinolatos encontrados nas dicotiledôneas. Atualmente é conhecido que o sistema mirosinase/glicosinolato ocorre em pelo menos 16 famílias de plantas incluindo as Caricaceaes (Rodman, 1991). Na família das Caricaceaes o benzilglicosinolato pode ser encontrado em todas as partes da planta, como também o metil-tiocianato e benzil-isotiocianato. Desse modo os resíduos de ditiocarbamatos obtidos por hidrólise ácida devem ser cuidadosamente interpretados em função das espécies analisadas. O objetivo deste trabalho foi estabelecer a faixa de concentração de CS2 fitogênico em Carica papaya L. variedade Golden cultivado sem qualquer exposição a agroquímicos sulfurados

Inhibition of IL-10 Production by Maternal Antibodies against Group B Streptococcus GAPDH Confers Immunity to Offspring by Favoring Neutrophil Recruitment

Group B Streptococcus (GBS) is the leading cause of neonatal pneumonia, septicemia, and meningitis. We have previously shown that in adult mice GBS glycolytic enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is an extracellular virulence factor that induces production of the immunosuppressive cytokine interleukin-10 (IL-10) by the host early upon bacterial infection. Here, we investigate whether immunity to neonatal GBS infection could be achieved through maternal vaccination against bacterial GAPDH. Female BALB/c mice were immunized with rGAPDH and the progeny was infected with a lethal inoculum of GBS strains. Neonatal mice born from mothers immunized with rGAPDH were protected against infection with GBS strains, including the ST-17 highly virulent clone. A similar protective effect was observed in newborns passively immunized with anti-rGAPDH IgG antibodies, or F(ab')2 fragments, indicating that protection achieved with rGAPDH vaccination is independent of opsonophagocytic killing of bacteria. Protection against lethal GBS infection through rGAPDH maternal vaccination was due to neutralization of IL-10 production soon after infection. Consequently, IL-10 deficient (IL-10−/−) mice pups were as resistant to GBS infection as pups born from vaccinated mothers. We observed that protection was correlated with increased neutrophil trafficking to infected organs. Thus, anti-rGAPDH or anti-IL-10R treatment of mice pups before GBS infection resulted in increased neutrophil numbers and lower bacterial load in infected organs, as compared to newborn mice treated with the respective control antibodies. We showed that mothers immunized with rGAPDH produce neutralizing antibodies that are sufficient to decrease IL-10 production and induce neutrophil recruitment into infected tissues in newborn mice. These results uncover a novel mechanism for GBS virulence in a neonatal host that could be neutralized by vaccination or immunotherapy. As GBS GAPDH is a structurally conserved enzyme that is metabolically essential for bacterial growth in media containing glucose as the sole carbon source (i.e., the blood), this protein constitutes a powerful candidate for the development of a human vaccine against this pathogen