Investigations on the performance of cell lines with cassette exchange system

Die kommerzielle Entwicklung von Produzentenzelllinien basiert meist auf der zufälligen Integration vieler Transgenkopien in das Wirtsgenom und der anschließenden Selektion zur Identifizierung stabiler Hochproduzenten. Das Rekombinase-vermittelte Kassettenaustauschsystem (RMCE) ist bereits in früheren Arbeiten als aussichtsreiche Alternative für die vorhersagbare Entwicklung von Zelllinien beschrieben worden. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung inwieweit RMCE-basierte Zelllinien im Vergleich zu konventionell entwickelten auch in Kultivierungsprozessen vorhersagbare und homogene Wachstums- und Produktionseigenschaften aufweisen. Aus diesem Grund war zunächst die parallele Entwicklung des RMCE-Systems sowie einer Modellzelllinie erforderlich. Die RMCE-kompatiblen Masterzelllinien wurden basierend auf CHO-Suspensionszellen mit eGFP-transduzierenden Lentiviren markiert. Nach der Identifikation austauschbarer und transkriptionell aktiver chromosomaler Loci wurden RMCE-Versuche mit drei vollständigen Antikörpern, einem Antikörper-Fragment und tPA durchgeführt. Die Selektion von RMCE-Subklonen erfolgte mittels zweifacher FACS-Anreicherung ohne Einsatz selektiver Agentien. Die Subklone wiesen eine homogene Expression auf, welche mit dem jeweiligen Targetingpool korrespondierte. Die Ergebnisse deuten jedoch nicht auf die universelle Einsetzbarkeit eines definierten Locus für die Expression verschiedener Proteine hin. Es scheint vielmehr, dass bestimmte Loci für die Expression bestimmter Proteine geeignet sind. Die GS-basierten Modellzelllinien, welche mittels zweifacher Nukleoporation generiert wurden, erzielten finale Titer von 3,5 g L-1 in Fed-Batch Versuchen. Die untersuchten Klone waren in Abwesenheit von MSX jedoch nicht langzeitstabil. Ferner konnte kein positiver Zusammenhang zwischen der MSX-Konzentration und der spezifischen Produktivität der GS-Klone erkannt werden. Bei den im Versuchsraum untersuchten Einflussfaktoren während der Fed-Batch Kultivierung zeigte sich, dass die drei von einem Transfektionspool stammenden GS6 Klone unterschiedlich signifikant beeinflusst werden. Dies korreliert mit den während der Klonselektion beobachteten heterogenen Produktivitäten der GS-Klone. Die drei RMCE-Klone, welche aus zwei unterschiedlichen Targetingpoolen hervorgegangen sind und zwei verschiedene vollständige Antikörper exprimierten, zeigten in Fed-Batch Kultivierungen innerhalb des Versuchsraumes vergleichbare Wachstums- und Produktionseigenschaften.Conventional cell line development is mostly based on random multicopy transgene integration followed by a time and labor consuming screening procedure to identify stable high-producer. Previous publications characterized the recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) as a promising alternative for the development of cell lines in a predictable manner. Aim of this thesis was to investigate whether RMCE-based cell lines reveal comparable and predictable growth and production characteristics in culture processes as well in comparison to conventional cell lines. For this reason the parallel development of the RMCE-system as well as a GS-based model cell lines was required. RMCE master cell lines based on CHO suspension cells were tagged with eGFP transducing lentiviruses. After having identified exchangeable and transcriptionally active chromosomal loci, RMCE experiments with three fullsize antibodies, one antibody fragment and tPA have been performed. The selection of positive RMCE-events was conducted via FACS without any selective agents. The transgene expression among the subclones was homogenous and moreover corresponding to the respective targetingpool. However, the results do not indicate the universal applicability of a certain chromosomal locus for recombinant protein expression. The results rather support the theory that some loci are appropriate for the expression of certain proteins, since the expression level among the full size antibodies was quite similar. The GS-based model cell lines were established after dual nucleofection and subsequent selection by means of a single cell secretion assay. In fed-batch processes the GS-model cell lines reached peak titers of 3.5 g L-1. However, in absence of MSX the clones were not stable. Moreover no positive correlation was observed between MSX-concentration (for gene amplification) and specific productivity of the respective GS-clones. Investigation of GS-clones within a defined design-space in fed-batch processes revealed different significantly influencing parameters among the clones deriving from a common pool. This result correlated with the heterogeneous productivities among the GS-clones during the clonal screening procedure. Three antibody producing RMCE-derived clones have been investigated exemplarily as well in fed-batch processes within a defined design space. All of them demonstrated comparable growth and production characteristics