Structural characterization of inhibitors of Pex14-Pex5 interaction from Trypanosoma brucei

Trypanosoma brucei to protist pasożytniczy odpowiedzialny za wywoływanie śpiączki afrykańskiej. Według statystyk Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) choroba ta zagraża 54 milionom ludzi na terenach Afryki Subsaharyjskiej. Niezależnie od tego, podgatunki T. brucei wywołują ogromne szkody gospodarcze, sięgające 1,3 miliarda dolarów rocznie. Obecnie stosowane leki przeciwko śpiączce afrykańskiej mają poważne efekty uboczne, niską skuteczność, zwłaszcza w przypadku chronicznych etapów choroby, oraz wymagają długiego czas leczenia. Z tego powodu poszukiwane są nowe leki, będące inhibitorami białek ważnych dla biologii T. brucei.Głównym źródłem energii dla T. brucei jest glikoliza, która zachodziw wyspecjalizowanych peroksysomach zwanych glikosomami. Kluczowe ze względu na biogenezę peroksysomów jest oddziaływanie pomiędzy cytozolowym receptorem Pex5, rozpoznającym białka (cargo), które mają trafić do wnętrza peroksysomów, oraz białkiem Pex14, znajdującym się w błonie peroksysomów i tworzącym wraz z Pex5 kompleks dokujący, dzięki któremu dochodzi do importu cargo do matriks peroksysomalnej.W ostatnich latach Pex14 został celem molekularnym w leczeniu śpiączki afrykańskiej. Zidentyfikowano pochodne pirazolo[4,3-c]pirydyny, które w wyniku optymalizacji ich struktury wykazują nanomolowe powinowactwo do Pex14 oraz są w stanie selektywnie zabijać komórki pasożytów. Dochodzi do tego wskutek nagromadzenia się enzymów glikosomalnych w cytozolu, przez co zapasy ATP zostają wyczerpane, a ufosforylowane metabolity glukozy akumulują się do toksycznego poziomu.Wciąż wymagana jest jednak dalsza optymalizacja nowo zidentyfikowanych syntetycznych inhibitorów małocząsteczkowych Pex14, aby mogły one zostaćw przyszłości lekami przeciwko śpiączce afrykańskiej. W badaniach tych pomocne jest projektowanie leków w oparciu o strukturę białka docelowego (Pex14). W pracy niniejszej zostały przedstawione struktury T. brucei Pex14 z dwoma nowymi inhibitorami, które służyć mogą do dalszej optymalizacji związków, celem znalezienia skuteczniejszego leku przeciwko śpiączce afrykańskiej.Trypanosoma brucei is a parasitic protozoan that is the cause of the sleeping sickness. According to the statistics of the World Health Organization (WHO), the disease threatens 54 million people in sub-Saharan Africa. Independently, subspecies of T. brucei cause enormous damage to the economies which amounts to 1.3 billion dollars annually. Currently used drugs against sleeping sickness are characterized by severe side effects, low efficacy, especially in the case of the chronic stages of the disease, and a long duration of treatment. For this reason, new drugs are searched for that are inhibitors of important proteins for the functioning of T. brucei.The main source of energy in T. brucei is glycolysis, which takes place in specialized peroxisomes called glycosomes. The key component for the biogenesis of these organelles is the interaction between cytosolic receptor Pex5, which recognizes proteins (cargos) that should be imported into the peroxisomes, and Pex14 protein, localized on the membrane of peroxisomes, which together with Pex5 forms the docking complex, by which the cargo is imported into the peroxisomal matrix.In recent years, Pex14 became a molecular target in the treatment of sleeping sickness. Derivatives of pyrazolo[4,3-c]pyridine were identified, which upon optimization of their structures show nanomolar affinity to the Pex14 and are able to selectively kill parasites’ cells. This is due to resulting accumulation of glycosomal enzymes in the cytosol, what results in the depletion of ATP and the accumulation of phosphorylated glucose metabolites to toxic levels.Further optimization of the newly identified synthetic small molecule inhibitors is still required to become drugs against sleeping sickness in the future. For this, the structure-based drug design is helpful based on the structure of the target protein (Pex14). In this thesis, the structures of T. brucei Pex14 with two new inhibitors are presented, which can serve to further optimize the compounds to find the effective drug against sleeping sickness

TPR domain of Pex5 Trypanosoma cruzi as new target in Chagas disease treatment

Choroba Chagasa jest potencjalnie zagrażającą życiu chorobą pasożytniczą wywoływaną przez pierwotniaka Trypanosoma cruzi. Początkowo była jedną z zaniedbywanych chorób tropikalnych, jednak obecnie zaczęła rozprzestrzeniać się z krajów endemicznych, stanowiąc coraz istotniejsze zagrożenie dla zdrowia i dobrobytu. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) zakażonych jest około 8 milionów ludzi na całym świecie, głównie w Ameryce Łacińskiej. W chwili obecnej dostępna jest ograniczona liczba sposobów leczenia, które ponadto wykazują toksyczność oraz ograniczoną skuteczność. Z tego powodu istotna jest identyfikacja nowych makromolekularnych celów dla leków niskocząsteczkowych.Jedynym źródłem energii dla Trypanosoma sp. jest glikoliza. Proces ten zachodziw wyspecjalizowanych peroksysomach, zwanych glikosomami. Biogeneza tych organelli zależy od białek zwanych Peroksynami (ang. Peroxins, Pex). Jednym z nich jest Peroksyna 5 (Pex5), która jest receptorem cytozolowym rozpoznającym peptyd sygnalny PTS1 znajdujący się na białkach przeznaczonych do transportu wewnątrz glikosomu. Siedem enzymów biorących udział w pierwszych etapach glikolizy zawiera PTS1. Rozpoznanie Pex5-PTS1 jest pierwszym etapem translokacji cargo do matriks glikosomu.Ostatnie badania wykazały, że blokowanie importu białek glikosomalnych poprzez hamowanie Pex5 prowadzi do selektywnej śmierci Trypanosoma. Jest to spowodowane akumulacją enzymów glikosomalnych w cytozolu. Skutkuje to wyczerpaniem zapasów ATP, akumulacją ufosforylowanych metabolitów glukozy do toksycznego poziomu, a w końcu do śmierci komórki pasożyta.Celem tej pracy była nadekspresja oraz oczyszczenie domeny TPR Pex5 Trypanosoma cruziw celu prób kokrystalizacji z małocząsteczkowymi inhibitorami. Przyszłe badania będą skupiać się na otrzymaniu struktury kompleksu białko-inhibitor w celu zaprojektowania związków o lepszych właściwościach, które będą mogły służyć jako leki przeciwko chorobie Chagasa.Chagas disease is a potentially life-threatening illness caused by protozoan parasite Trypanosoma cruzi. Originally it was a neglected tropical disease, but it has spread from endemic countries and currently starts to threaten human health and welfare worldwide. According to World Health Organization (WHO) about 8 million people worldwide are infected, mostly in Latin America. Only a limited number of treatment options are available, and they suffer from toxicity as well as limited efficacy. Therefore, an identification of new macromolecular drug targets and a small-molecule modulators is of utmost importance. The only source of energy in Trypanosoma sp. is glycolysis. This process takes place in specialized peroxisomes called glycosomes. The biogenesis of these organelles depends ona number of proteins named Peroxins (Pex). One of them is a cytosolic receptor Peroxin 5 (Pex5), which recognizes peroxisomal targeting signal 1 (PTS1) of proteins that are directed to peroxisomal matrix. In fact, in Trypanosoma, the first seven glycolytic enzymes are cargos recognized by Pex5. This carrier-cargo recognition is the first step in protein translocation across the glycosomal membrane.Recent studies demonstrated that blocking the glycosomal protein import by inhibiting the Pex5 protein carrier selectively kills Trypanosoma. It is caused by the mislocation of glycolytic enzymes to the cytosol. This leads to ATP depletion and accumulation of phosphorylated glucose metabolites to the toxic levels, resulting in parasite’s cell death.The aim of this study was to overexpress and purify the TPR domain of Pex5 Trypanosoma cruzi for crystallization trials with small-molecule inhibitors. Future goals will concentrate on obtaining protein-inhibitor complex structure for further development and rational design of the Pex5 targeting compounds that may serve as drugs against trypanosomiasis

Crystal structures of apo- and FAD-bound human peroxisomal acyl-CoA oxidase provide mechanistic basis explaining clinical observations

Peroxisomal acyl CoA oxidase 1a ACOX1a catalyzes the first and rate limiting step of fatty acid oxidation, the conversion of acyl CoAs to 2 trans enoyl CoAs. The dysfunction of human ACOX1a hACOX1a leads to deterioration of the nervous system manifesting in myeloneuropathy, hypotonia and convulsions. Crystal structures of hACOX1a in apo and cofactor FAD bound forms were solved at 2.00 and 2.09 resolution, respectively. hACOX1a exists as a homo dimer with solvation free energy gain amp; 916;Go of amp; 8722;44.7 kcal mol amp; 8722;1. Two FAD molecules bind at the interface of protein monomers completing the active sites. The substrate binding cleft of hACOX1a is wider compared to human mitochondrial very long chain specific acyl CoA dehydrogenase. Mutations p.G178C, p.M278V and p.N237S reported to cause dysfunctionality of hACOX1a are analyzed on its 3D structure to understand structure function related perturbations and explain the associated phenotype