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Toxicidad "in vitro" en granulocitos de sangre periferica: Aplicaci贸n de la citometr铆a de flujo al estudio de las alteraciones inmunitarias en el ejercicio.
RESUMEN
El desarrollo de modelos de toxicidad in vitro es de gran inter茅s en los campos de la Farmacolog铆a y la Toxicolog铆a bioqu铆micas tanto para la detecci贸n inicial de fen贸menos f谩rmaco-t贸xicos, como para el estudio de los mecanismos moleculares implicados.
Los granulocitos de sangre perif茅rica desempe帽an un papel esencial en la inmunidad inespec铆fica con funciones que implican a la membrana plasm谩tica, las mitocondrias y los lisosomas. Las funciones bioqu铆micas de los granulocitos de sangre perif茅rica son muy sensibles a los cambios metab贸licos en el indiv铆duo entero y se relacionan con la presencia de diferentes mediadores fisiol贸gicos o mol茅culas t贸xicas circulantes.
La citometr铆a de flujo es una t茅cnica muy 煤til para el an谩lisis multiparam茅trico de c茅lulas individuales y la detecci贸n de alteraciones estructurales y funcionales. Por sus caracter铆sticas estructurales, los granulocitos son identificados f谩cilmente por citometr铆a de flujo, permitiendo su an谩lisis espec铆fico, sin necesidad de etapas de purificaci贸n.
Es evidente el beneficio que el ejercicio f铆sico supone sobre pr谩cticamente todos los aspectos de la salud y se han realizado estudios que demuestran que el ejercicio es un regulador de la funci贸n inmunol贸gica. Aunque a煤n existen aspectos poco claros en cuanto a su influencia sobre el sistema inmune, parece existir relaci贸n entre la intensidad y duraci贸n del ejercicio, y la magnitud y direcci贸n de los cambios en los contajes y porcentajes de los leucocitos circulantes en sangre. Lo mismo sucede con la funci贸n aunque las alteraciones funcionales no est谩n relacionadas con los cambios num茅ricos.
El presente trabajo eval煤a la utilidad de los granulocitos de sangre perif茅rica como c茅lula diana para el desarrollo de modelos de alteraci贸n funcional in vitro que pudieran ser aplicados a la detecci贸n de efectos t贸xicos, as铆 como al estudio de los mecanismos funcionales implicados en situaciones fisiopatol贸gicas que afecten al Sistema Inmunitario.
Tambi茅n se plantea aplicar la capacidad anal铆tica de la citometr铆a de flujo multiparam茅trica para el an谩lisis funcional de los granulocitos y la comparaci贸n de sus respuestas con la de otras c茅lulas inmunitarias en los modelos de toxicidad a desarrollar. Se plantea as铆 mismo aplicar los aspectos metodol贸gicos desarrollados al estudio del posible papel del estr茅s oxidativo en las alteraciones funcionales inducidas en los granulocitos y otras c茅lulas inmunitarias por el ejercicio f铆sico de alta intensidad.
Los objetivos planteados se abordan a trav茅s de un estudio integrado, mediante citometr铆a de flujo (EPICS Elite) para el estudio de suspensiones de leucocitos de sangre perif茅rica, obtenidas tras la depleci贸n de hemat铆es por sedimentaci贸n sobre Ficoll-Histopaque y separaci贸n celular por "cell sorting". Los granulocitos son identificados y preseleccionados por sus cacter铆sticas morfol贸gicas, mediante an谩lisis de la dispersi贸n frontal y lateral de luz. Una primera fase in vivo analiza muestras procedentes de indiv铆duos sometidos a un esfuerzo f铆sico de alta intensidad. El posible papel del estr茅s oxidativo en las alteraciones funcionales de los granulocitos observadas in vivo, se estudia en una segunda fase en un modelo in vitro de exposici贸n controlada a concentraciones subletales de agentes pro-oxidantes, solubles (como el per贸xido de hidr贸geno (H2O2)) y de membrana (como el per贸xido de tert-butilo (tBOOH)). En las suspensiones de leucocitos aislados se determina el Potencial de Membrana Mitocondrial (PMM, con Rhodamina 123), la generaci贸n de H2O2- y Super贸xido (con Dihydrodiclorofluoresceina (DHDCF) e Hydroethidina (HE)) y los niveles de Glutation (GSH con Naranja de Mercurio), as铆 como la expresi贸n de CD69 y CD25. La expresi贸n de las 尾2-integrinas CD18, CD11a, CD11b y CD11c, se han determinado en condiciones basales y tras estimulaci贸n con PMA o FMLP.
En ambos modelos se analiza la distribuci贸n, estado de activaci贸n, respuesta mitog茅nica y generaci贸n de especies reactivas de ox铆geno en las diferentes subpoblaciones leucocitarias. Los estudios citom茅tricos sobre el modelo in vitro aborda fundamentalmente los fen贸menos de expresi贸n de mol茅culas de adhesi贸n de la familia de las integrinas, en condiciones basales y tras estimulaci贸n quimiot谩ctica o activaci贸n de la protein kinasa C, por la especial relevancia de dichas mol茅culas en la funcionalidad de los granulocitos y su papel en los fen贸menos de interacci贸n de los mismos con otras c茅lulas implicadas en las alteraciones funcionales inducidas por el ejercicio f铆sico intenso.
Las determinaciones demuestran que el ejercicio f铆sico intenso induce una disminuci贸n en el porcentaje de linfocitos T citot贸xicos, linfocitos T inductores de cooperaci贸n y c茅lulas Natural Killer, aumentando el porcentaje de linfocitos T inductores de supresi贸n. En este modelo se produce un incremento de las c茅lulas T que expresan el receptor de Interleukina-2, acompa帽ado de una mayor capacidad de respuesta a la activaci贸n mitog茅nica in vitro. Sin embargo, dichas c茅lulas utilizan con menos eficacia la Interleukina-2 ex贸gena, sugiriendo la existencia de interferencias con el mecanismo de transducci贸n de la se帽al de activaci贸n. Adem谩s la incubaci贸n in vitro con dosis no letales de prooxidantes ex贸genos induce un estr茅s oxidativo intracelular en los leucocitos, pero no provoca la activaci贸n de los linfocitos. Los prooxidantes ex贸genos, en general, incrementan la expresi贸n espont谩nea de mol茅culas de adhesi贸n, los niveles intracelulares de especies reactivas de ox铆geno y modifican la sobreexpresi贸n inducida por est铆mulos quimiot谩cticos o activadores de la protein kinasa C en granulocitos y monocitos, lo que sugiere la existencia de un posible estr茅s oxidativo en dichas c茅lulas y por tanto de un desequilibrio entre prooxidantes y antioxidantes que puede participar en las alteraciones de la funci贸n inmunitaria espec铆fica e innata. Los granulocitos han respondido de forma m谩s sensible y consistente que los monocitos a la acci贸n in vitro de los oxidantes ex贸genos. Por 煤ltimo, la utilizaci贸n de la citometr铆a de flujo multiparam茅trica para determinar la funcionalidad de los granulocitos, c茅lulas f谩ciles de estudiar selectivamente, podr铆a representar una aproximaci贸n de inter茅s para la detecci贸n y an谩lisis de fen贸menos de citotoxicidad que afecten al Sistema Inmunitario.
__________________________________________________________________________________________________AIMS: To evaluate the utility of whole blood granulocytes as useful cells in the development of in vitro models of functional disturbance in order to detect toxic effects, to study the functional mechanisms of the Inmunitary System and to determine by flow cytometry (CMF) the in vitro effects of oxidative stress on the functional status of leukocytes in whole blood, assessed by analysis of mitochondrial function, intracellular prooxidants, early- and late activation markers and cell adhesion molecules.
METHODS: Whole blood samples were in vivo processed by CMF after a high intensity physical exertion and in vitro incubated with sublethal concentrations of soluble (H2O2) and membrane (t-Butyl hydroperoxyde) prooxidants. Mitochondrial membrane potential (MMP, with Rhodamine 123), H2O2- and superoxide generation (with dihydrodiclorofluorescein (DHDCF) and hydroethidine) and glutathione levels (GSH with Mercury Orange) were determined in isolated leukocytes suspensions. CD69 and CD25 expression was determined in whole blood leukocytes. 尾2-integrins (CD18, CD11a, CD11b and CD11c) were determined in basal conditions and following cell stimulation with PMA or FMLP. All the analysis were performed with an EPICS XL flow cytometer.
RESULTS: High intensity physical exertion modified lymphocyte subpopulations with different functional implication and also the activation state of these cells, and increased metabolic activity, basal integrin expression and H2O2 intracellular levels in granulocytes and monocytes. Extracellular prooxidants induced in all leukocytes significant increase of intracellular oxidants and MMP and decreased cell GSH. There were no changes in the distribution of lymphocyte subpopulations. CD69 and CD25 were not affected. The effects on 尾2-integrins were complex and more significant in granulocytes: in general, low-concentration of prooxidants enhanced basal integrin expression, while higher concentrations tended to decreased the expression. Also, oxidative stress decreased the sttimulatory effect of FMLP and PMA, specially in the granulocyte subpopulations. In all cases, CD11b and CD11c were the most affected molecules by prooxidants.
CONCLUSIONS: The effect of intense physical exercise increase T-cells with an IL-2 receptor and more responsive to the mitogenic activation, but used less effectively exogenous IL-2. In intense physical exercise occur functional changes in granulocytes which are evident by increased metabolic activity, basal integrin expression and intracellular levels of reactive oxygen species. Exogenous prooxidants in vitro induce intracellular oxidative stress and have complex effects on the expression of 尾2-integrins in leukocytes, specially in granulocytes. The use of flow cytometry to determine the functionality of granulocytes could be of interest to detect and study cytotoxicity events that affect the Inmune System