Développement d’un outil génétique pour la création de collections de mutants : application à l’étude de la paroi fongique chez Botrytis cinerea

La paroi fongique est une structure essentielle des champignons qui demeure étonnamment mal connue malgré 50 ans de recherche. La perturbation ou l'inhibition de sa biosynthèse peut en-traîner une diminution de la vitesse de croissance fongique, une sensibilité accrue au stress et/ou une diminution de la virulence chez les espèces pathogènes. Dans certains cas elle est même létale. Cette paroi est composée en grande majorité de polysaccharides formant un réseau tridi-mensionnel rigide et protecteur pour le microorganisme. Néanmoins, cette composition évolue de manière dynamique, en fonction du développement du champignon et des conditions envi-ronnementales. La synthèse des polysaccharides est réalisée par des enzymes membranaires appartenant à la famille des glycosyltransférases. Ces enzymes étant spécifiques du règne des champignons, elles constituent une cible de choix dans la lutte antifongique. Les polysaccharide synthases les mieux caractérisées produisent deux polysaccharides impor-tants de la paroi fongique, la chitine et le β-1,3-glucane. En revanche, d’autres polysaccharides pariétaux attendent que leurs enzymes de synthèse soient identifiées et, inversement, des en-zymes prédites à partir des séquences génomiques, et présentant une signature de polysaccharide synthase, attendent la démonstration de leur implication dans la synthèse pariétale et l’identification du polysaccharide qu’elles produisent. Cette thèse avait pour objectif d’étudier le rôle de 10 glycosyltransférases dans la biologie d’un champignon phytopathogène majeur, l’agent de la pourriture grise Botrytis cinerea. Afin d’obtenir une collection de 10 souches fongiques dépourvues chacune de l’un des 10 gènes codant pour les enzymes ciblées, un nouveau système de mutagénèse a été exploré pour améliorer les outils moléculaires jusque là disponibles chez B. cinerea. Ce système a intégré une sélection négative basée sur l’utilisation d’une défensine d’insecte pour accélérer la sélection des mutants recherchés en éliminant les transformants génétiquement modifiés dans un autre locus que le locus ciblé. La démonstration de l’efficacité de la défensine a été faite et ce travail explo-ratoire a permis de démontrer, contrairement à l’idée répandue dans la communauté, que la bac-térie Agrobacterium tumefaciens était très efficace pour opérer une mutagénèse ciblée chez B. cinerea. Le nouveau système de mutagenèse s’est donc avéré inutile, mais les 10 souches mutantes recherchées ont pu être obtenues. La souche délétée du gène Bccps1 a été étudiée en profondeur. Ceci a permis de montrer que l’absence de la glycosyltransférase BcCPs1 conduit à une forte diminution de la croissance fon-gique, à des modifications de la paroi du champignon et à une diminution de sa virulence. De plus, ce travail a révélé un rôle pour cette enzyme dans l’adhérence du champignon à des sur-faces hydrophobes et l’existence de 2 phases dans le développement de la colonie fongique, phénomène non décrit jusque là. Par ailleurs, les premières caractérisations des 9 autres souches mutantes ont mis en évidence des phénotypes marquants (diminution de la virulence, absence de reproduction asexuée, défaut de formation de sclérotes, résistance ou sensibilité à des stress) et ont ainsi enrichi la liste des glycosyltransférases importantes dans la biologie de B. cinerea et représentant de nouvelles cibles antifongiques potentielles. Lors de cette thèse, des outils ont également été développés pour l’étude de la paroi de B. cinerea.The fungal cell wall is an essential structure of fungi that remains surprisingly poorly understood despite 50 years of research. Disruption or inhibition of its biosynthesis can lead to a decrease in fungal growth rate, increased sensitivity to stress and/or a decrease in virulence in pathogenic species. In some cases it is even lethal. This cell wall is mainly composed of polysaccharides forming a rigid and protective tridi-mensional network for the microorganism. Nevertheless, this composition evolves dynamically, depending on the development of the fungus and environmental conditions. The synthesis of polysaccharides is carried out by membrane enzymes belonging to the glycosyltransferase family. As these enzymes are specific to the fungi kingdom, they are a prime target for antifungal control. The best characterised polysaccharide synthases produce two important polysaccharides of the fungal cell wall, chitin and β-1,3-glucan. However, other parietal polysaccharides await identification of their synthetic enzymes and, conversely, enzymes predicted from genomic sequences, and having a polysaccharide synthase signature, await demonstration of their involvement in parietal synthesis and identification of the polysaccharide they produce. The aim of this thesis was to study the role of 10 glycosyltransferases in the biology of a major phytopathogenic fungus, the grey mould agent Botrytis cinerea. In order to obtain a collection of 10 fungal strains each lacking one of the 10 genes coding for the targeted enzymes, a new mutagenesis system was explored to improve the molecular tools previously available in B. cinerea. This system incorporated negative selection based on the use of an insect defensin to accelerate the selection of the desired mutants by eliminating transformants genetically modified at a locus other than the target locus. The effectiveness of the defensin was demonstrated and this exploratory work made it possible to show, contrary to the widespread belief in the community, that the Agrobacterium tumefaciens bac-steria was very effective in carrying out targeted mutagenesis in B. cinerea. The new mutagenesis system was therefore unnecessary, but the 10 mutant strains sought could be obtained. The strain with the Bccps1 gene deleted was studied in depth. This showed that the absence of the glycosyltransferase BcCPs1 leads to a strong decrease in fungal growth, changes in the fungal wall and a decrease in virulence. In addition, this work revealed a role for this enzyme in the adhesion of the fungus to hydrophobic surfaces and the existence of two phases in the development of the fungal colony, a phenomenon not previously described. In addition, the first characterisations of the 9 other mutant strains revealed striking phenotypes (reduced virulence, absence of asexual reproduction, lack of sclerotia formation, resistance or sensitivity to stresses) and thus enriched the list of glycosyltransferases important in the biology of B. cinerea and representing new potential antifungal targets. During this thesis, tools were also developed for the study of the cell wall of B. cinerea

Evidencing New Roles for the Glycosyl-Transferase Cps1 in the Phytopathogenic Fungus Botrytis cinerea

International audienceThe fungal cell wall occupies a central place in the interaction between fungi and their environment. This study focuses on the role of the putative polysaccharide synthase Cps1 in the physiology, development and virulence of the grey mold-causing agent Botrytis cinerea. Deletion of the Bccps1 gene does not affect the germination of the conidia (asexual spores) or the early mycelial development, but it perturbs hyphal expansion after 24 h, revealing a two-phase hyphal development that has not been reported so far. It causes a severe reduction of mycelial growth in a solid medium and modifies hyphal aggregation into pellets in liquid cultures. It strongly impairs plant penetration, plant colonization and the formation of sclerotia (survival structures). Loss of the BcCps1 protein associates with a decrease in glucans and glycoproteins in the fungus cell wall and the up-accumulation of 132 proteins in the mutant’s exoproteome, among which are fungal cell wall enzymes. This is accompanied by an increased fragility of the mutant mycelium, an increased sensitivity to some environmental stresses and a reduced adhesion to plant surface. Taken together, the results support a significant role of Cps1 in the cell wall biology of B. cinere