Increased insight into the hydrolysis of starch by amylolytic enzymes

Zetmeel is het belangrijkste reservepolymeer dat voorkomt in gewassen zo als maïs, rijst, tarwe en aardappelen. Het is hoofdzakelijk opgebouwd ui t twee glucosepolymeren: (1) amylose, een grotendeels lineair polymeer e n (2) amylopectine, een sterk vertakt polymeer. Amylasen van verschillende oorsprong hydrolyseren de glycosidische verbi ndingen van zetmeel op een verschillende, niet-willekeurige manier. Hoew el de eerste hydrolytische aanval min of meer op een willekeurige plaats in zetmeelmolecules gebeurt, hangt de manier waarop de zetmeelstructuur wordt gewijzigd door enzymatische hydrolyse onder andere af van het act iepatroon van het gebruikte amylase. Dit doctoraat had als doel het inzi cht in de zetmeelhydrolyse door amylasen te verfijnen en de relatie tuss en het actiepatroon van amylasen en de zetmeeleigenschappen na (beperkte ) amylolyse te verduidelijken. De multiple attack-actie, die inhoudt dat een amylase verschillende glyc osidische bindingen splitst na de eerste random hydrolytische aanval en voor het dissocieert van zijn substraat, wordt frequent gebruikt om vers chillen in actiepatronen van amylasen te verklaren. In deze context word t de degree of multiple attack (DMA) gedefinieerd als het aantal binding en die gehydrolyseerd worden tijdens de levensduur van een enzym-substra at-complex min 1 (namelijk de eerste random hydrolytische aanval). In het eerste deel van het experimentele werk, werden de actiepatronen v an verschillende amylasen op aardappelamylose bestudeerd aan de hand van de relatie tussen de daling in de iodiumwaarde (een maat voor de daling van het moleculair gewicht van amylose) en de toename in de totale redu cerende waarde (een maat voor het aantal hydrolytische aanvallen) tijden s de hydrolyse. Voor de verschillende bestudeerde amylasen waren deze re laties verschillend, wat wijst op een niet-willekeurige hydrolyse van am ylose. DMA-waarden van de verschillende amylasen werden berekend als de verhouding tussen de toename in totale reducerende waarde (dRVTS) en de toename in gevormde reducerende polysachariden (dRVPS) min 1 tijdens de hydrolyse van aardappelamylose. Het maltogeen alfa-amylase v an Bacillus stearothermophilus (ook als Geobacillus s tearothermophilus gekend) (BStA) (12.1) had de hoogste DMA, gevo lgd door PPA (8.0). De alfa-amylases van B. licheniformis, (BLA) (4.7), B. amyloliquefaciens (BAA) (3.9), Th ermoactinomyces vulgaris (TVA, alfa-amylase I) (3.8) en van B. subtilis (BSuA) (3.1) hadden intermediaire DMA-waarden. Het al fa-amylase van Aspergillus oryzae (TAKA) (2.5) had de laagste DMA. Er werd aangetoond dat de totale reducerende waarde die overeenste mt met een daling van de relatieve iodium-waarde tot 80% (RV80-waa rde) een alternatief is voor de complexe DMA-bepaling. De RV80-waa rden op amylose van de bestudeerde amylasen waren in het algemeen gelijk aardig of hoger wanneer de temperatuur werd verhoogd, waarbij de mate va n toename afhankelijk was van het amylase. Voor het maltogene BStA werd, opmerkelijk, een verlaagde graad van multiple attack vastgesteld bij ee n toename van de temperatuur. Dit impliceert een meer uitgesproken endo- actie. In het algemeen is amylopectine het belangrijkste substraat bij de hydro lyse van zetmeel. Het blijft echter onduidelijk of een amylase amylopect ine eveneens via een multiple attack-actie hydrolyseert. Gebaseerd op de resultaten met amylose werden voor dit deel van het werk vijf amylasen geselecteerd met significant verschillende actiepatronen: BAA en TAKA, e ndo-alfa-amylasen met respectievelijk een intermediaire en een lage DMA, PPA, een endo-alfa-amylase met een hoge DMA, het maltogeen amylase BStA en als laatste, BCB als referentie voor een exo-hydrolyserend enzym. In een eerste reeks van experimenten, werden de actiepatronen van deze a mylasen met amylopectine als substraat onderzocht op een gelijkaardige m anier als voor amylose. De relatie tussen de relatieve iodium-waarde en de hoeveelheid reducerende suikers vrijgezet tijdens de amylolyse van am ylopectine, toonde aan dat amylopectine niet volledig willekeurig werd g ehydrolyseerd. Verder kon besloten worden dat de verhouding dRVPS/ dRVTS een waardevolle maat is voor de hydrolyse van de interne ket ens ten opzichte van de gehele hydrolyse van de amylopectine-structuur, en werd de nieuwe term level of inner chain attack (LICA), geïntroduceer d. BAA en TAKA hydrolyseerden de langere interne ketens van amylopectine in grotere mate dan PPA. Voor BStA en BCB was de hydrolyse van de inter ne ketens van amylopectine verwaarloosbaar tot zelfs onbestaand. De DMA-waarden op amylose, de LICA-waarden, de aard van de tijdens de hy drolyse teruggevonden oligosachariden en de residuele amylopectinestruct uur zijn hoogstwaarschijnlijk gerelateerd. De LICA-waarde bepaalt hoofdz akelijk de impact van het amylase op de grootte van amylopectine. Amylas en met een hoge LICA, zoals BAA en TAKA, reduceren de macromoleculaire g rootte van amylopectine drastisch reeds vanaf de beginfase van de hydrol yse. Amylasen met een lage of verwaarloosbare LICA, zoals PPA en BStA, r educeren de moleculaire grootte van amylopectine veel trager met toeneme nde graad van solubilisatie. Voor een zekere hoeveelheid oligosachariden gedetecteerd, wijzigden BAA en TAKA de gemiddelde ketenlengte (CL) en d e ketenlengteverdeling van amylopectine drastisch, terwijl voor PPA de a fbraak van de amylopectine-structuur (CL en ketenlengteverdeling) minder sterk uitgesproken was. Bijkomend werden voor PPA verschillende subpopu laties (met degree of polymerisation (DP) 2-3, DP 7-8 and DP 10-11) van amylopectineketens met gelijkaardige relatieve hoeveelheden gedetecteerd tijdens de latere fases van de hydrolyse. Voor BAA en TAKA, waren de re sultaten in overeenstemming met het vrijzetten van eerder grote oligosac hariden, gecombineerd met een lage graad van multiple attack op de amylo pectineketens. Voor PPA kunnen de resultaten verklaard worden door het v oornamelijk vrijzetten van maltose in combinatie met een hoge graad van multiple attack-actie op amylopectine. In overeenstemming met zijn exo-a ctie, hydrolyseerde BCB uitsluitend de externe ketens van amylopectine e n reduceerde daarbij nauwelijks de moleculaire grootte van amylopectine. BCB voerde verschillende opeenvolgende aanvallen (multiple attacks) uit op het substraat, waarbij maltose werd vrijgezet en trimde hierbij de e xterne amylopectine ketens successief af tot DP 2 of 3. Slechts wanneer grote hoeveelheden oligosachariden werden vrijgezet, was de CL van het r esiduele amylopectine gereduceerd en werden de wijzigingen in de amylope ctine-ketenlengteverdeling significant. Het maltogene BStA hydrolyseerde tijdens de beginfase van de hydrolyse bij voorkeur externe ketens van a mylopectine, ongeveer gelijkaardig aan een exo-amylase. Tijdens de later e fases van de hydrolyse hydrolyseerde het ook interne ketens en wijzigd e daarbij de amylopectinestructuur op een meer uitgesproken wijze. De mu ltiple attack-actie was, op een analoge manier als voor PPA, weerspiegel d in het voorkomen van verschillende subpopulaties bij DP 2, DP5-6 en DP 8 in de lage DP regio van de amylopectine-ketenlengteverdeling. Samengevat dragen deze resultaten bij tot een verhoogd inzicht in de ver schillen in actiepatronen van de amylasen, waartoe verschillen in onder andere vrijgezette oligosachariden, verschillen in LICA en verschillen i n graad van multiple attack behoren en die weerspiegeld worden in het am ylopectinestructuur na hydrolyse. Op dit ogenblik is echter geen methode beschikbaar voor de bepaling van de DMA op de amylopectineketens, niett emin zijn we ervan overtuigd dat deze waarde gecorreleerd is met de DMA- waarde op amylose. Om de relatie tussen zetmeeleigenschappen, amylase-eigenschappen en zetm eelhydrolyse meer in detail te bestuderen, werd de hydrolyse van drie ve rschillende zetmelen van maïs (dent, waxy and hoog-amylose), zowel verst ijfseld als natief, door vijf verschillende amylasen (BAA, TAKA, PPA, BS tA and BCB) bestudeerd. De gesolubiliseerde reducerende suikers (SSre d) en de totale hoeveelheid koolhydraten (als glucose) gesolubiliseer d (TSSgluc) werden bepaald tijdens hydrolyse. Wanneer de amylasen werden vergeleken, werden minstens tijdens de beginf ase van de hydrolyse geen significante verschillen gevonden in SSred gesolubiliseerd in functie van de tijd voor de drie verschillende ver stijfselde substraten. Verschillen in de TSSgluc profielen werden voornamelijk bepaald door de verschillende oligosachariden die werden ge detecteerd bij de hydrolyse van verstijfseld zetmeel. Verstijfseld hoog-amylose-maïszetmeel werd op een verschillende manier g ehyrolyseerd dan verstijfseld dent- en waxy-maïszetmeel. Hoog-amylose-ze tmeel is een belangrijke bron van type III enzymweerstandig zetmeel wat kan verklaren waarom, tijdens de latere fases van de hydrolyse, SSred va n verstijfseld hoog-amylose-maïszetmeel significant lager was dan van ve rstijfseld dent- en waxy-maïszetmeel. In tegenstelling tot wat werd vastgesteld voor verstijfseld zetmeel en h oewel gelijkaardige enzymactiviteiten werden toegevoegd, verschilden de SSred profielen tijdens alle fases van de hydrolyse van natief zet meel wanneer verschillende amylasen werden vergeleken. Voor de drie vers chillende endo-alfa-amylasen (PPA, BAA and TAKA), werd een duidelijke co rrelatie vastgesteld tussen de relatieve graad van adsorptie aan het opp ervlak van granulair zetmeel en de (initiële) hoeveelheid gesolubiliseer de reducerende suikers. BCB solubiliseerde tijdens natieve zetmeelhydrol yse in het algemeen een lagere hoeveelheid reducerende suikers dan de en do-alfa-amylases. Initieel solubiliseerde het maltogeen alfa-amylase&nbs p;BStA tijdens de natieve zetmeelhydrolyse een zeer grote hoeveelheid re ducerende suikers. Zoals voor de endo-alfa-amylasen, kan dit wellicht ve rklaard worden door de bijna volledige adsorptie van BStA aan de zetmeel granules. De verschillen tussen de oligosachariden gedetecteerd tijdens hydrolyse van de natieve zetmelen door de verschillende amylasen waren m inder significant dan bij hydrolyse van de corresponderende verstijfseld e zetmelen. In het algemeen werden hoofdzakelijk kleine oligosachariden, zoals maltose en maltotriose, gedetecteerd. De verschillen in multiple attack- actie zullen voornamelijk weerspiegeld zijn in de residuele stru ctuur van de zetmeelpolymeren na hydrolyse. Het is echter mogelijk dat d eze verschillen weerspiegeld werden in de hoeveelheid suikers die in opl ossing werden gebracht. Zetmelen met een verschillende amylose/amylopectine-verhouding werden in verschillende mate gesolubiliseerd. Voor alle amylasen vertoonde natief hoog-amylose-maïszetmeel de hoogste resistentie tegen hydrolyse terwijl de verschillen in hydrolyseprofielen tussen natief dent-maïszetmeel en natief waxy-maïszetmeel eerder klein tot zelfs verwaarloosbaar waren en bovendien afhankelijk van het amylase. Tenslotte was de relatie tussen d e graad van adsorptie aan de zetmeelgranule en de graad van solubilisati e niet éénduiding wanneer de verschillende substraten werden vergel eken.Table of contents i List of abbreviations v Summary vii Samenvatting xi Introduction xv Part One: LITERATURE REVIEW 1 Chapter I: STARCH – composition, structure and physico-chemical behaviour 3 Introduction 3 I.1 Starch composition 3 I.1.1 Amylose 4 I.1.2 Amylopectin 5 I.1.3 Minor components 8 I.2 Starch structure 9 I.2.1 Starch granule: growth rings, lamella and blocklets 9 I.2.2 Starch structure: crystallinity 14 I.3 Physico-chemical behavior of starch 15 I.3.1 Gelatinisation and pasting 16 I.3.2 Retrogradation 18 I.3.2.1 Amylose solution 18 I.3.2.2 Amylopectin solution 18 I.3.2.3 Starch 19 I.4 Relation between starch structure and physico-chemical behaviour 20 I.4.1 Influence of amylose content 21 I.4.2 Influence of amylopectin structure 22 Chapter II: AMYLASES – starch hydrolysing enzymes 25 Introduction 25 II.1 Glycoside hydrolases 25 II.1.1 Classifications 25 II.1.2 Catalytic structure 26 II.1.3 Catalytic mechanism 27 II.2 Family 13 glycosyl hydrolases 28 II.3 Family 14 and family 15 glycosyl hydrolases 31 II.4 Action pattern of amylases 33 II.4.1 Definitions 33 II.4.2 Experimental analysis of the action pattern 35 II.4.2.1 The first reports on multiple attack action 35 II.4.2.2 Amylose as a substrate 36 II.4.2.3 Malto-oligosaccharides as a substrate 37 II.4.2.4 Amylopectin as substrate 37 II.4.2.5 Multiple versus preferred attack 38 II.4.3 Influence of pH and temperature on the action pattern 39 II.4.4 Mechanism of multiple attack 40 Chapter III: AMYLOLYTIC HYDROLYSIS OF STARCH 45 Introduction 45 III.1 Industrial applications of amylases 45 III.2 Starch amylolysis 46 III.3 Starch amylolysis depends on the characteristics of the starch 49 III.3.1 Granular characteristics 49 III.3.2 Amylose/amylopectin content and structure 50 III.3.3 Crystallinity 52 III.4 Starch amylolyis depends on the characteristics of the amylase 52 Final considerations 54 Part Two: EXPERIMENTAL WORK 57 Chapter IV: AMYLASES – action pattern on amylose 59 Introduction 59 IV.1 Materials and methods 60 IV.1.1 Materials 60 IV.1.2 Amylase activity assay 60 IV.1.3 Action pattern with potato amylose 61 IV.1.3.1 Amylose solution 61 IV.1.3.2 Amylose hydrolysis 62 IV.1.3.3 Blue value of the hydrolysate 62 IV.1.3.4 Total level of reducing sugars of the hydrolysate (RVTS) 62 IV.1.3.5 Level of reducing polysaccharides of the hydrolysate (RVPS) 62 IV.1.3.6 Calculation of RV80, RV50 and DMA 63 IV.1.3.7 Statistical evaluation 63 IV.1.4 Action pattern with chromophoric substrates 64 IV.1.4.1 Azurine-crosslinked amylose 64 IV.1.4.2 Soluble red starch chromophoric substrate 64 IV.2 Results and discussion 66 IV.2.1 Action pattern on potato amylose in solution 66 IV.2.1.1 Action pattern and DMA at 35 °C 66 IV.2.1.2 RV80-value as an expression for the multiple attack action 68 IV.2.1.3 Effect of temperature on the action pattern 70 IV.2.1.4 Mechanism of multiple attack 73 IV.2.2 Action pattern with chromophoric substrates. 75 IV.3 Conclusion 80 Chapter V: AMYLASES – hydrolysis of amylopectin 81 Introduction 81 V.1 Materials and methods 82 V.1.1 Materials 82 V.1.2 Amylase activity assay 82 V.1.3 Action pattern with maize amylopectin 83 V.1.3.1 Amylopectin solution and hydrolysis 83 V.1.3.2 KI/I2-value of the hydrolysates 84 V.1.3.3 Total level of reducing sugars of the hydrolysate (RVTS) 84 V.1.3.4 Level of reducing polysaccharides of the hydrolysates (RVPS) 84 V.1.3.5 Calculation of RV80, RV50 and DMA 84 V.1.4 Structural analysis of amylopectin residues after limited amylolysis 84 V.1.4.1 (Limited) amylolysis of gelatinised waxy maize starch 85 V.1.4.2 Analysis of soluble oligosaccharides 86 V.1.4.3 HPAEC-PAD 86 V.1.4.4 Molecular size distribution of intact and residual amylopectin 86 V.1.4.5 Fine structure of intact and residual amylopectin 87 V.1.5 Statistical evaluation 87 V.2 Results and discussion 88 V.2.1 Action pattern on amylopectin in solution 88 V.2.1.1 Action pattern at 35 °C 88 V.2.1.2 Effect of temperature on the action pattern. 91 V.2.1.3 Value of the method used to study the action pattern of amylases on amylopectin. 92 V.2.2 Structural analysis of amylopectin residues after limited amylolysis 95 V.2.2.1 (Limited) amylolysis of gelatinised waxy maize starch 95 V.2.2.2 Molecular size and fine structure of (partially) hydrolysed amylopectin. 98 V.2.3 The action pattern of an amylase reflected in the residual amylopectin structure? 105 V.2.3.1 Non-maltogenic alpha-amylases 105 V.2.3.2 beta-Amylase 107 V.2.3.3 Maltogenic alpha-amylase 108 V.2.3.4 Amylopectin hydrolysis: multiple attack or level of inner chain attack? 109 V.3 Conclusion 111 Chapter VI: AMYLASES – hydrolysis of starch 113 Introduction 113 VI.1 Materials and methods 114 VI.1.1 Materials 114 VI.1.2 (Limited) Hydrolysis of gelatinised starch 114 VI.1.3 Adsorption of amylase 115 VI.1.4 (Limited) Hydrolysis of native starch 115 VI.2 Results and discussion 116 VI.2.1 (Limited) Hydrolysis of gelatinised starch 116 VI.2.2 Native starch hydrolysis 125 VI.2.2.1 Adsorption of amylases 125 VI.2.2.2 Hydrolysis of native starches by different amylases 127 VI.2.3 Conclusions 138 General conclusions and perspectives for further work 141 References 145 List of tables 163 List of figures 165 List of publications 173nrpages: 198status: publishe

Hydrolysis of amylopectin by amylolytic enzymes: structural analysis of the residual amylopectin population

Amylopectin fine structures were studied following limited hydrolysis of gelatinised waxy maize starch by amylases with a different level of inner chain attack (LICA). This was done by size exclusion chromatography as well as by debranching the (partially hydrolysed) amylopectin samples and studying the size distributions of the released chains. alpha-Amylases from Bacillus amyloliquefaciens and Aspergillus oryzae, with a relatively high LICA, drastically altered amylopectin chain length distribution and reduced the amylopectin molecular size (MS) significantly even at a low to moderate degree of hydrolysis (DH). Porcine pancreatic alpha-amylase (PPA), with a rather low LICA but a high multiple attack action on amylose, reduced the amylopectin MS much slower. Following hydrolysis by PPA to a DH of 10% and enzymic debranching of the amylopectin residue, several subpopulations of chains consisting of 2-12 glucose units were detected, indicating a multiple attack action on the amylopectin side chains. During the early stages of hydrolysis, the maltogenic Bacillus stearothermophilus alpha-amylase (BStA) preferentially hydrolysed the exterior chains of amylopectin. However, during the later phases, BStA also hydrolysed inner chains, presumably with a high multiple attack action. The present results clearly show that different enzymes can be used for (limited) conversion of amylopectin into structures differing in molecular weight and chain length distributions. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.status: publishe

Hydrolysis of amylopectin by amylolytic enzymes: level of inner chain attack as an important analytical differentiation criterion

Differences in amylase action pattern on amylopectin were demonstrated by the relation between the decrease in potassium iodide-iodine binding of waxy maize starch and the increase in reducing value during hydrolysis, as expressed by the RV80 value (i.e., the reducing value for a potassium iodide-iodine binding value of 80% of that of the starting material). In the initial stages of the hydrolysis, the ratio of the increase in the level of reducing polysaccharicles to the increase in the total level of reducing sugars formed during amylolysis of amylopectin can be considered as a measure of the level of inner chain attack (LICA) in the overall hydrolysis of the amylopectin structure and correlated with the respective RV80 value. Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase and Aspergillus oryzae alpha-amylase, with the lowest RV80 and the highest LICA values, hydrolysed the inner chains of amylopectin to a greater extent than did porcine pancreatic alpha-amylase. In the initial stages of hydrolysis, Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase, like the Bacillus cereus beta-amylase, did not display any significant degree of internal hydrolysis of amylopectin, in line with the high RV80 and very low LICA values for these enzymes. However, at the later stages of hydrolysis, the maltogenic amylase probably exhibited a significant degree of internal hydrolysis of amylopectin, which itself seems to depend on temperature. The temperature dependence of the hydrolysis pattern of this enzyme is relevant for interpretation of its action as antifirming enzyme in bread-making applications. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.status: publishe

Amylase action pattern on starch polymers

Several decades ago, the first reports on differences in action pattern between amylases from different sources indicated that the starch polymers are not degraded in a completely random manner. We here give an overview of different action patterns of amylases on amylose and amylopectin, focusing on the so-called multiple attack action of the enzymes. Nowadays, the multiple attack action is generally an accepted concept to explain the differences in amylase action pattern. However, the pancreatic alpha-amylase remains one of the few enzymes known with a considerable level of multiple attack action. Despite some recent studies, the molecular mechanism of the multiple attack action is still largely unclear. Probably, the degree to which the active site architecture and binding properties allow both the reorganization (sliding) of the substrate in the active site and the stabilisation of the productive enzyme/substrate complex mainly determine the multiple attack action of amylases.status: publishe

Influence of amylases on the rheological and molecular properties of partially damaged wheat starch

The effects of Bacillus subtilis, porcine pancreatic and Aspergillus oryzae alpha-amylases, sweet potato beta-amylase and Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BStA) on the rheological properties (measured with a Rapid Visco Analyser) of partially damaged wheat starch were studied and the accompanying changes in starch molecular properties were analysed by high-performance size exclusion chromatography. Pasting and gelation of starch slurries (with an increased level of damaged starch) were significantly affected by the supplemented amylases and greatly depended on the mode of action and properties of the enzymes added. In general, at low endo-amylase concentrations, peak, hot paste and cold paste viscosities were more reduced for enzyme-supplemented partially damaged starch than for enzyme-supplemented native wheat starch, demonstrating the significance of damaged starch levels in determining amylase functionality. Higher dosages of thermostable amylases ruled out most of the differences between amylase-supplemented native starch and partially damaged starches, except for B&A. Furthermore, the (limited) endo-action of BStA determines to a great extent the rheological properties of the starch paste. These results contribute to a better understanding of (maltogenic) amylase functionality in processing (damaged) starch-containing foods. (c) 2006 Society of Chemical Industrystatus: publishe