Hitchhiking through the amnion/chorion: redefining the migratory route of primordial germ cells in chicken embryos

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Primordial germ cells (PGCs) are the founders of the gametes. They are one of the first discernible embryonic cell types which are set aside very early in the developing embryo. As it happens in other organisms, in chicken embryos, PGCs migrate from their extraembryonic location to combine with the somatic component of the gonad. An ingression of PGCs from the hypoblast into the vascular system, around stage HH8-10, was previously addressed using SSEA-1 as a marker for PGCs. Nonetheless, the isolation of the chicken vasa homolog (cvh), which is known to play a role in chicken germline, and the production of an antibody against VASA protein, permitted its use as a reliable marker to analyze the migration process of PGCs in chicken embryos. In this work we compared the specificity of VASA antibody with the specificity of SSEA-1 antibody for PGCs at different developmental stages. We concluded that SSEA-1 is not a specific marker for PGCs. Therefore we decided to characterize the position of PGCs, in different developmental stages, using VASA antibody. We identified the presence of PGCs in one structure that was not related with their migration in chicken embryos, or even in other animal model: the amnion/chorion. Taking advantage of the easiness of chicken embryos manipulation, we preformed a functional study to understand if amnion/chorion is having a role on PGCs migration. Our experiments demonstrated that embryos cultured with a modified “cornish pasty” method have a normal development, regarding the body structures and also the extra and intraembryonic vascular system. However the development of somatopleure is affected, and there is no separation between chorion and amnion or development of the amnion/chorion fold. The absence of PGCs in the genital ridges at stage HH17 and their presence in the somatopleure, allowed us to conclude that the developing amnion/chorion is involved in the migration process of PGCs.A formação de órgãos durante o desenvolvimento embrionário baseia-se na cooperação de diferentes tipos celulares. Algumas células são definidas a alguma distância do local onde o futuro órgão se formará. A migração celular é um fenómeno central em vários momentos do desenvolvimento embrionário permitindo que estas células se desloquem até à estrutura onde virão, mais tarde, a desempenhar o seu papel biológico correctamente. As células germinais primordiais (CGPs) são um dos primeiros tipos celulares a distinguirem-se no embrião. As CGPs constitutem as progenitoras dos gâmetas desempenhando, por isso, uma função fundamental nos organismos sexuados. Depois de especificadas as CGPs são mantidas longe da gónada, até ao momento em que os movimentos celulares embrionários estabilizam, o que permite que mantenham a sua identidade. Mais tarde, as células iniciam a sua migração em direcção às gónadas, onde encontrarão as células somáticas ali presentes que lhes servirão de suporte nutritivo, o que permitirá seu correcto desenvolvimento. Ao atingirem a gónada esta fica apta a produzir gâmetas femininos ou masculinos, processo que se completará na puberdade. Os gâmetas são responsáveis por uma parte da variabilidade dos organismos sexuados, sendo por isso células com um papel muito importante tanto ao nível biológico individual como ao nível evolutivo. No caso da ave, a migração das CGPs ocorre da parte anterior extraembrionária para uma parte posterior do embrião, as cristas genitais, local onde se formará a futura gónada. Inicialmente, no estádio X (Eyal-Giladi and Kochav), as CGPs encontram-se no epiblasto, mais precisamente no centro da zona pelúcida. As células são deslocadas até ao hipoblasto. Durante a formação da linha primitiva as CGPs são transferidas para uma região extraembrionária, anterior à linha primitiva em desenvolvimento, denominada crescente germinal. É na zona do crescente germinal que estas células se incorporam na rede vascular aí formada, durante os estádios HH8-10, migrando pelo sistema vascular do embrião, até atingirem as futuras gónadas entre os estádios HH15-19. No entanto alguns destes estudos foram realizados usando marcadores não específicos para esta linha celular, nomeadamente o stage specific embryonic antigen 1 (SSEA-1). Neste trabalho avaliámos a especificidade do marcador SSEA-1 nestas células. Usámos como marcador mais fidedigno o anticorpo contra VASA, proteína que sabemos estar envolvida na identificação destas células em diferentes grupos taxonómicos ao longo da evolução (incluíndo o grupo Gallus gallus). Ao longo nosso trabalho, o marcador SSEA-1 não se revelou específico desta linha celular, sobretudo em estádios mais precoces. Esta observação levou-nos à necessidade de caracterizar a posição destas células no embrião de galinha, em diferentes estruturas embrionárias ao longo de vários estádios de desenvolvimento, a fim de perceber melhor o seu processo de migração. Ao analisar imunohistoquimicamente embriões entre os estádios de desenvolvimento HH5-19, deparámos com a presença destas células, em estádios HH8-13, numa estrutura nunca antes referida no seu processo de migração: o âmnio/córion. Para compreender se o âmnio e o córion têm um papel na migração das CGPs, cultivámos embriões de galinha pelo método de cultura “cornish pasty”. Este método de cultura in vitro, permite o correcto desenvolvimento do embrião com excepção do desenvolvimento da somatopleura e da prega amniótica, que devido à ausência de pressão da cabeça sobre os tecidos adjacentes, não consegue elevar-se sobre o embrião. Desta forma, a somatopleura continua o seu desenvolvimento à volta da área extraembrionária. A análise imunohistoquímica destes embriões, permitiu concluir que as CGPs no estádio HH10 se encontram no local onde seriam encontradas num embrião com desenvolvimento in ovo (localizadas numa posição anterior à cabeça, e na qual, num embrião com desenvolvimento in ovo se elevaria a prega amniótica). No entanto em estádios intermédios (HH13) estas células encontram-se na somatopleura. Verificámos também que a presença destas células nesta estrutura se mantêm em estádios mais avançados (HH17), nos quais é de esperar a presença das CGPs nas futuras gónadas. A partir destas observações concluímos que estas células estão a usar esta estrutura numa parte inicial da sua migração. Ao longo deste trabalho deparámo-nos com lacunas na literatura à cerca do âmnio que, desta forma, encontrámos algumas lacunas na literatura relativamente aos mecanismos inerentes ao seu desenvolvimento. Assim, usando técnicas histológicas tradicionais aliadas a técnicas de live imaging, procedemos à análise do desenvolvimento desta estrutura que pensamos ter um papel importante na migração das CGPs. Concluímos dessa forma que esta estrutura extraembrionária parece ter um desenvolvimento dependente da formação da cabeça embrionária e do proamnio. O proamnion, estrutura diblástica anterior à cabeça, estará a servir de “clip”, possibilitanto que a cabeça “mergulhe” sobre os tecidos subjacentes à mesma, ajudando ao correcto desenvolvimento da prega amniótica mediana pre-axial sobre a cabeça. A integração dos dados obtidos neste trabalho, levou-nos a propor um novo mecanismo de migração para estas células com uma fase transitória de migração através do âmnio/córion. As CGPs, inicialmente presentes no epiblasto e mais tarde deslocadas para o hipoblasto, são depois incorporadas na mesoderme. A mesoderme, que ingressa pela linha primitiva, dará origem à espancnopleura e somatopleura. Estas duas estruturas estão envolvidas na formação do sistema vascular extraembrionário e do âmnio/córion, respectivamente. Assim o nosso modelo considera que as CGPs, presentes na mesoderme, durante a formação da somatopleura e da esplancnopleura, são incorporadas na somatopleura. O nosso modelo não exclui o facto de que algumas destas células poderão ficar na mesoderme que, em conjunto com a endoderme, formará a esplancnopleura e que por essa razão tenham sido identificadas nas ilhas sanguíneas, em estádios precoces do desenvolvimento (HH1O). O facto de as CGPs usarem o âmnio/córion como estrutura transitória na sua migração poderá estar relacionado com o facto de as CGPs, apesar de mais tarde usarem o sistema vascular para se deslocarem até à futura gónada, estarem a evitar os processos envolvidos na vasculogénese e angiogénese que estão a ocorrer ao nível das ilhas sanguíneas. Durante o processo de vasculogénese e angiogénese são recrutados inúmeros sinais químicos e parácrinos que poderiam conduzir a uma alteração da linhagem das CGPs. O âmnio e o córion foram uma das novidades evolutivas mais importantes no decurso da evolução, permitindo a independência de ambientes aquáticos para a reprodução. Permitiram a exploração de uma enorme variabilidade de nichos terrestres. No entanto, parece-nos que além da sua função como protector da dissecação em amniotas, esta estrutura poderá estar a ser usada em outros processos embrionários. Este trabalho veio assim redefinir o papel do âmnio/córion na migração das CGPs. Esta estrutura extra-embrionária, constitui um suporte com características que permitem a manutenção da estaminidade celular, como tem sido descrito recentemente. Este trabalho demonstra assim a necessidade de um estudo mais aprofundado deste anexo embrionário que poderá ter mais aplicações, na área das células estaminais, do que inicialmente se esperava, sendo o facto de as CGPs estarem a usá-lo no seu processo de migração um indicador revelador dessa capacidade de manutenção da estaminidade celular