Protein hydrolysis by immobilized and stabilized trypsin

El pdf del artículo es la versión pre-print.-- et al.The preparation of novel immobilized and stabilized derivatives of trypsin is reported here. The new derivatives preserved 80% of the initial catalytic activity toward synthetic substrates [benzoyl-arginine p-nitroanilide (BAPNA)] and were 50,000-fold more thermally stable than the diluted soluble enzyme in the absence of autolysis. Trypsin was immobilized on highly activated glyoxyl-Sepharose following a two-step immobilization strategy: (a) first, a multipoint covalent immobilization at pH 8.5 that only involves low pKa amino groups (e.g., those derived from the activation of trypsin from trypsinogen) is performed and (b) next, an additional alkaline incubation at pH 10 is performed to favor an intense, additional multipoint immobilization between the high concentration of proximate aldehyde groups on the support surface and the high pKa amino groups at the enzyme surface region that participated in the first immobilization step. Interestingly, the new, highly stable trypsin derivatives were also much more active in the proteolysis of high molecular weight proteins when compared with a nonstabilized derivative prepared on CNBr-activated Sepharose. In fact, all the proteins contained a cheese whey extract had been completely proteolyzed after 6 h at pH 9 and 50°C, as determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Under these experimental conditions, the immobilized biocatalysts preserve more than 90% of their initial activity after 20 days. Analysis of the three-dimensional (3D) structure of the best immobilized trypsin derivative showed a surface region containing two amino terminal groups and five lysine (Lys) residues that may be responsible for this novel and interesting immobilization and stabilization. Moreover, this region is relatively far from the active site of the enzyme, which could explain the good results obtained for the hydrolysis of high-molecular weight proteins. © 2011 American Institute of Chemical Engineers (AIChE).Peer Reviewe

Macaúba (Acrocomia aculeata) cake from biodiesel processing: a low-cost substrate to produce lipases from Moniliella spathulata R25L270 with potential application in the oleochemical industry

[Background]: Biodiesel industry wastes were evaluated as supplements for lipase production by Moniliella spathulata R25L270, which is newly identified yeast with great lipolytic potential. Macaúba cake (MC), used for the first time in this work as inducer to produce lipases, and residual oil (RO) were mixed to maximise enzyme production. The lipase secreted was biochemically characterised.[Results]: The best ratio for the mixture (MC:RO) was 0.66:0.34 and the fitted values for lipase activity and total protein concentration were 0.98 U mL−1 and 0.356 mg mL−1, respectively. Maximum activity obtained (2.47 U mL−1) was achieved at 31.5°C and pH 6.7, and the enzyme was stable in this condition. A novel enzyme was purified and identified for the first time by mass spectrometry. The lipase efficiently hydrolysed different natural oils and exhibited selectivity in the production of eicosapentaenoic acid from fish oil.[Conclusion]: The use of MC and RO as a supplement to produce the new lipase from M. spathulata R25L270 may be one alternative for reducing lipase production costs and simultaneously adding value to biodiesel industry residues. The potential application of the lipase in the oleochemical industry was demonstrated by its pH and temperature stabilities and selective hydrolysis.This research was supported by Brazilian agencies: CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), INCT (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia) de Nanomateriais de Carbono, FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais), Rede Mineira de Toxinas com Ação Terapêutica and CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior).Peer reviewe

Ingeniería de biocatalizadores y bioprocesos: β-Galactosidasa de Thermus sp., cepa T2

Tesis doctoral del Departamento de Ingeniería Química Industrial y del Medio Ambiente, E.T.S.I. Industriales (UPM).Las β-galactosidasas (EC.3.2.1.23), son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces galactosídicos β-1,4. Estas enzimas se encuentran distribuidas en la naturaleza en numerosos microorganismos, en plantas y en tejidos animales. Su aplicación fundamental está en las reacciones de hidrólisis de lactosa en productos y subproductos lácteos (leche, sueros de quesería, etc). El motivo fundamental de su aplicación radica esencialmente en dos postulados: 1.- Eliminación total de lactosa en leche, de gran interés, ya que constituye un contratiempo importante para personas que no son capaces de metabolizar libremente ese disacárido, ya sea, porque hayan perdido esa capacidad de forma hereditaria o por algún accidente de tipo metabólico. Este problema lo padece un porcentaje basante alto de la población mundial (en torno al 70%), siendo más severo en las poblaciones de raza negra. La supresión completa del hábito de ingerir productos lácteos, puede traer graves consecuencias al organismo humano, ya que este producto constituye la dieta fundamental para el aporte de muchas proteínas, vitaminas y otras fuentes de energía, con lo cual esta deficiencia puede, incluso provocar la muerte del individuo intolerante. 2.- A escala industrial, su eliminación constituye un importante avance, en la producción y maduración de quesos, ya que el proceso se vería acelerado al usar las bacterias responsables en los procesos fermentativos glucosa, más fácilmente dirigida, en vez de hacerlo con lactosa. Otra de las implicaciones industriales importantes radica en la eliminación de este disacárido en los residuos formados tras la producción de quesos. Estos residuos poseen una elevada DQO, cerca de 50 a 100.000 mg/L, lo que en términos medioambientales constituye un handicap importante (ahora que la legislación castiga severamente estas infracciones). Así, la búsqueda de enzimas capaces de ser aplicadas de forma simultánea con procesos químicos industriales que ocurren a elevadas temperaturas (dígase Pasteurización, UHT etc), se hace imprescindible, para mejorar la asepsia del proceso, ya que por un lado realizamos el tratamiento térmico y por el otro, el tratamiento microbiológico del mismo. Así aplicando técnicas de ingeniería genética para clonación de microorganismos termófilos, difíciles de crecer en fermentadores industriales en microorganismos mesófilos, facilita su fermentación y procesamiento a escala industrial, constituyendo un importante ahorro en términos económicos del proceso. Como la industria alimentar exige unas condiciones de pureza importantes, los proceso de purificación enzimáticas previos son necesarios. De esta forma, también se pudo acudir a técnicas de ADN recombinante para insertar un vector portador de una secuencia aminoacídica constituida por Histidinas, que deben interaccionar con soportes con quelatos metálicos, por afinidad, facilitando la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad a quelatos metálicos (IMAC). Posteriormente, se llevaron a cabo estudios para la inmovilización y estabilización de la proteína, (en soportes tipo sepabeads modificados con boronatos y/o con quelatos metálicos), facilitando así la recuperación final del catalizador y su reutilización, constituyendo también un ahorro económico.La realización de esta Tesis ha sido posible gracias a la concesión de una Beca por parte del Gobierno de la República de Angola, en el programa de formación de cuadros por parte del "Instituto Nacional de Bolsas de Estudos" adscrito al Ministerio de Educación y Cultura, bajo la dirección de los Doctores Alfonso Vicente Carrascosa Santiago, José Manuel Guisán Seijas y Alicia Larena Pellejero

Inmovilización y estabilización de la beta-galactosidasa de E. coli para la síntesis de galacto-oligosacaridos

Resumen del póster presentado en las I Jornadas Científicas CIAL Forum 2014, celebrado en Madrid el 5 de junio de 2014.-- et al.La inmovilización de enzimas es una técnica que surgió en el siglo XX y tiene vital importáncia en vários procesos biotecnológicos y de entre los vários procedimentos podemos destacar dos principales: inmovilización de forma reversible y la inmovilización de forma irreversible o covalente. Así, en este trabajo se han estudiado diferentes estrategias de inmovilización y estabilización de la β-galactosidasa de E. coli producida y expresada en la cepa MC1116 perteneciente a la colección del grupo MICROBIO del CIAL. La enzima fue inmovilizada sobre diferentes soportes (CNBr, DEAE, MANAE-Agarosa y Glioxil-Agarosa), con una posterior caracterización bioquímica de los derivados obtenidos antes de las reaciones de síntesis. Para estudiar la estabilidad térmica de los derivados, las muestras fueron incubadas a 40°C, 50°C y 60°C respectivamente, alcanzándose en todos los procesos buenos niveles de estabilización: DEAE y Glioxil-Agarosa presentaron niveles de estabilización por encima del 90%, CNBr (67%) y MANAE-Agarosa (57%). Los derivados fueron testados en diferentes condiciones de pH 5,0 y 7,0 y, posteriormente, las reaciones de síntesis fueron testadas igualmente en estos dos pH. Para estudiar la síntesis de GOS, usamos concentraciones de lactosa al 30%. Con los derivados Glioxil-Agarosa a pH 7,0 se ha podido obtener rendimientos del orden del 38% (suma total de GOS) después de una hora de reacción, y el derivado preparado sobre MANAE-Agarosa ha dado un rendimiento cercano a 25% de GOS. Con este trabajo podemos demostrar que, la inmovilización de una misma enzima, sobre diferentes soportes, puede promover unos rendimientos de síntesis y/o hidrólisis muy diferentes unos de otros, por la modulación que se haya podido promover en la estructura 3D.Los autores agradecen a CAPES y FAPERGS (Agencias financiadores de becas del gobierno Brasileño) por la concesión de la beca y la dirección del Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL-CSIC, por permitir realizar parte de mi doctorado en Madrid, España.Peer reviewe

Inmovilización y estabilización de lipasas para su aplicación en el tratamiento de efluentes que contienen grasas

Resumen del trabajo presentado a las III Jornadas Científicas CIAL Fórum, celebradas del 22 al 23 de noviembre de 2018 en el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL).La utilización de las lipasas ha sido muy recomendada en la degradación biológica y en la de la carga lipidica de efluentes industriales e industrias de alimentos en general (Dicosimo et al., 2013). La selección de nuevas enzimas y la producción de enzimas recombinantes por tecnología del ADN recombinante permitió la modificación de propiedades cinéticas y de estabilidad, el desarrollo de nuevas soluciones a nivel de la tecnología de reactores enzimáticos y de las técnicas de inmovilización (Guisan, 2006). La inmovilización de una enzima consiste en el confinamiento de la proteína en un soporte sólido insoluble o en una matriz de confinamiento, obteniendo de esta forma el derivado enzimático deseado, considerado una de las herramientas más eficientes para alterar la especificidad, selectividad, actividad y estabilidad de las enzimas (Souza et al 2016; Henriques, 2016 ). En este trabajo se utilizaron lipasas de Candida antarctica genéticamente modificada y expresadas en Escherichia coli, por el grupo del Dr. Benevides Pessela. La enzima fue inmovilizada por adsorción a soportes Octyl-Agarosa, por unión iónica a Monoaminoetil-N-Etil (MANAE), y por unión covalente multipuntual a soportes bifuncionales Aminoglioxil-Agarosa. Los derivados se caracterizaron en ensayos de inactivación por pH y estabilidad térmica, y los resultados fueron comparados con la enzima inmovilizada a bromocianógeno (BrCN) por unión covalente unipuntual, que se comporta como la enzima soluble, evitando posibles problemas de agregación. El derivado preparado sobre soporte bifuncional Aminoglioxil-Agarosa presentó un factor de estabilización de alrededor de 150 veces mayor en relación al CNBr a pH 7,0 y 45 ºC. Los derivados producidos, serán testados en el Simulador Gastrointestinal Dinámico (Simgi), en el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL) con el objetivo de estudiar el efecto de la inmovilización en la especificidad de cada uno de ellos frente a diferentes grasas.Peer reviewe

Optimization of the production and characterization of lipase from Candida rugosa and Geotrichum candidum in soybean molasses by submerged fermentation

This present work describes the production and biochemical characterization of lipase by Candida rugosa and Geotrichum candidum in a culture supplemented with soybean molasses. After optimizing the fermentation times for both microorganisms, the effects of changing the soybean molasses concentration, the fermentative medium pH and the fermentation temperature were evaluated using the Central Composite Planning. When soybean molasses was used at a concentration of 200 g/L at 27 ± 1 °C and pH 3.5, the lipolytic activity measured in the broth was 12.3 U/mL after 12 h for C. rugosa and 11.48 U/mL after 24 h for G. candidum. The molecular masses were 38.3 kDa to G. candidum lipase and 59.7 kDa to C. rugosa lipase, determined by SDS-PAGE. The lipase from both microorganisms exhibited maximal hydrolytic activity at a temperature of 40 °C and were inhibited at pH 10.0. Using different concentration of p-nitrophenylbutyrate (p-NPB), the kinetic parameters were calculated, as follows: the Km of lipase from G. candidum was 465.44 μM and the Vmax 0.384 μmol/min; the Km and Vmax of lipase from C. rugosa were 129.21 μM and 0.034 μmol/min, respectively. Lipases activity were increased by metallic ions Mg2+ and Na+ and inhibited by metallic ion Cu3+.The authors wish to thank CAPES (Brazil) for financial support through the scholarship of master and doctorate provided by the post-graduate program and “Programa de Doutorado Sanduiche no Exterior” (PDSE) abroad by the project BEX 14174/13-8.Peer Reviewe

Síntesis heteróloga de quimosina bovina, en Escherichia coli, para su uso en alimentación

Resumen del trabajo presentado a las III Jornadas Científicas CIAL Fórum, celebradas del 22 al 23 de noviembre de 2018 en el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL).La obtención del desarrollado de un nuevo sistema de producción heterologa de la quimosina bovina en Esterichia coli, consistió en la clonage del gen sintético optimizado en el uso de codones de la quimosina B bovina en el vector pBAD/HIS, bajo el control PBAD inducible por L arabinosa. La sobreexpresión del gen, genera cuerpos de inclusión de proquimosina que son desnaturalizados mediante NaoH, para posterior replegar la quimosina mediante su dilución y ajuste de pH con glicina. Una vez plegada la proquimosina se activa mediante cambios de pH. Las unidades de coagulación de la leche (IMCUS) de la quimosina recombinante que se ha obtenido en la fermentación una vez optimizada son de aproximadamente 1000/L de cultivo por unidad de DO600. Para concentrar la quimosina recombinante obtenida, se eligieran dos estrategias: la primero usando el equipo Speed bac, que nos brinda un porcentaje de 99% de muestras sin actividad, la segunda se utilizó el liofilizador obteniendo una concentración superior a enzima antes de liofilizar de casi 3,4 veces.Los autores: agradecen al Ministerio do Ensino Superior Ciencia Tecnologia e Inovaçao de Angola y al Centro Nacional de Investigaçao Cientifíca de Angola por la financiación recibidaPeer reviewe

Stabilization of lipase from Thermomyces lanuginosus by crosslinking in PEGylated polyurethane particles by polymerization: Application on fish oil ethanolysis

The adsorption of Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) on PEGylated polyurethane particles as support permitted the development of several strategies to improve the properties of this commercial low-cost enzyme. The supports were synthesized by miniemulsion technique using isophoronediisocyanate (IPDI) and poly(ε-caprolactone) diol (PCL530) as monomers. The aqueous phase was composed of distilled water, surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS), and poly(ethylene glycol) with different molar mass (PEG 400, 4000 or 6000). Polyethyleneimine (PEI) and trehalose were used to coat the PU-PEG polyurethane particles in order to increase the stability. In general, the coating with PEI (20%) allowed a greater stability of the derivatives. (100% of relative activity at 50 °C during 8 h). TLL immobilized on PEGylated polyurethane particles was efficiently used in the production of ethyl esters from fish oil compared to the free TLL (data not shown). The values of ethyl esters production of EPA and DHA were dependent on the support used for immobilization, which proved to be a determining factor in the activity. The highest selectivity obtained value was 45.8 for the PU-PEG4000-PEI20 derivative.The authors thank the financial support from CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) for the Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior, Project BEX 2569/14-0 and the direction of the Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación for helping in the development of this work.Peer Reviewe

Beauveria bassiana Lipase A expressed in Komagataella (Pichia) pastoris with potential for biodiesel catalysis

et al.Lipases (EC 3.1.1.3) comprise a biotechnologically important group of enzymes because they are able to catalyze both hydrolysis and synthesis reactions, depending on the amount of water in the system. One of the most interesting applications of lipase is in the biofuel industry for biodiesel production by oil and ethanol (or methanol) transesterification. Entomopathogenic fungi, which are potential source of lipases, are still poorly explored in biotechnological processes. The present work reports the heterologous expression and biochemical characterization of a novel Beauveria bassiana lipase with potential for biodiesel production. The His-tagged B. bassiana lipase A (BbLA) was produced in Komagataella pastoris in buffered methanol medium (BMM) induced with 1% methanol at 30°C. Purified BbLA was activated with 0.05% Triton X-100 and presented optimum activity at pH 6.0 and 50°C. N-glycosylation of the recombinant BbLA accounts for 31.5% of its molecular weight. Circular dichroism and molecular modeling confirmed a structure composed of α-helix and β-sheet, similar to α/β hydrolases. Immobilized BbLA was able to promote transesterification reactions in fish oil, demonstrating potential for biodiesel production. BbLA was successfully produced in K. pastoris and shows potential use for biodiesel production by the ethanolysis reaction.This work was supported by grants from Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (FAPESP-CSIC, process 2013/50892-5), Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), National System for Research on Biodiversity (SisbiotaBrazil, CNPq 563260/2010-6/FAPESP n◦ 2010/52322-3) and CNPq Biodiesel Process n◦ 406838/2013-5. FAG Torres, JJ, MLTP and RJ Ward are Research Fellows of CNPq. FA Facchini was FAPESP fellows; AV and MGP were CNPq fellows, AC and CC were CAPES fellows.Peer Reviewe