In Silico and In Vitro Evaluation of Bevacizumab Biosimilar MB02 as an Antitumor Agent in Canine Mammary Carcinoma

Canine mammary carcinomas (CMC) are associated with major aggressive clinical behavior and high mortality. The current standard of care is based on surgical resection, without an established effective treatment scheme, highlighting the urgent need to develop novel effective therapies. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a key regulator of tumor angiogenesis and progression in the majority of solid cancers, including human and canine mammary carcinomas. The first therapy developed to target VEGF was bevacizumab, a recombinant humanized monoclonal antibody, which has already been approved as an anticancer agent in several human cancers. The goal of this work was to establish the therapeutic value of MB02 bevacizumab biosimilar in CMC. First, through different in silico approaches using the MUSCLE multiple-sequence alignment tool and the FoldX protein design algorithm, we were able to predict that canine VEGF is recognized by bevacizumab, after showing an extremely high sequence similarity between canine and human VEGF. Further, by using an ELISA-based in vitro binding assay, we confirmed that MB02 biosimilar was able to recognize canine VEGF. Additionally, canine VEGF-induced microvascular endothelial cell proliferation was inhibited in a concentration-dependent manner by MB02 biosimilar. These encouraging results show a high potential for MB02 as a promising therapeutic agent for the management of CMC.Fil: Cardama, Georgina Alexandra. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Oncología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Bucci, Paula Lorena. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Oncología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Lemos, Jesus. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Oncología Molecular; ArgentinaFil: Llavona, Candela. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Oncología Molecular; ArgentinaFil: Benavente, Micaela Andrea. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Oncología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Hellmén, Eva. Gobierno de la Provincia de Buenos Aires. Hospital El Cruce Doctor Nestor Carlos Kirchner. Centro de Medicina Traslacional.; ArgentinaFil: Fara, María Laura. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Fisiopatología. Laboratorio de Endocrinología; ArgentinaFil: Medrano, Eduardo. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Fisiopatología. Laboratorio de Endocrinología; ArgentinaFil: Spitzer, Eduardo. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Fisiopatología. Laboratorio de Endocrinología; ArgentinaFil: Demarco, Ignacio A.. No especifíca;Fil: Sabella, Patricia. No especifíca;Fil: Garona, Juan. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina. Provincia de Buenos Aires. Ministerio de Salud. Hospital Alta Complejidad en Red El Cruce Dr. Néstor Carlos Kirchner Samic; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Alonso, Daniel Fernando. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

In Silico and In Vitro Evaluation of Bevacizumab Biosimilar MB02 as an Antitumor Agent in Canine Mammary Carcinoma

Simple Summary Canine mammary carcinomas (CMC) are associated with poor clinical outcomes and high mortality. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a key regulator of angiogenesis and tumor progression in many solid tumors, including mammary carcinomas. The goal of this work was to establish the therapeutic value of MB02 monoclonal antibody biosimilar to bevacizumab that targets VEGF in CMC. For this purpose, first, we were able to predict in silico that bevacizumab was able to recognize and bind canine VEGF. This was confirmed in vitro using an ELISA-based assay. Additionally, canine VEGF-induced microvascular endothelial cell proliferation was inhibited in a concentration-dependent manner by MB02 biosimilar. These results show a high potential for MB02 as a promising therapeutic agent for the management of CMC. Canine mammary carcinomas (CMC) are associated with major aggressive clinical behavior and high mortality. The current standard of care is based on surgical resection, without an established effective treatment scheme, highlighting the urgent need to develop novel effective therapies. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a key regulator of tumor angiogenesis and progression in the majority of solid cancers, including human and canine mammary carcinomas. The first therapy developed to target VEGF was bevacizumab, a recombinant humanized monoclonal antibody, which has already been approved as an anticancer agent in several human cancers. The goal of this work was to establish the therapeutic value of MB02 bevacizumab biosimilar in CMC. First, through different in silico approaches using the MUSCLE multiple-sequence alignment tool and the FoldX protein design algorithm, we were able to predict that canine VEGF is recognized by bevacizumab, after showing an extremely high sequence similarity between canine and human VEGF. Further, by using an ELISA-based in vitro binding assay, we confirmed that MB02 biosimilar was able to recognize canine VEGF. Additionally, canine VEGF-induced microvascular endothelial cell proliferation was inhibited in a concentration-dependent manner by MB02 biosimilar. These encouraging results show a high potential for MB02 as a promising therapeutic agent for the management of CMC

Efecto de la oxitocina sobre la funcionalidad del cuerpo lúteo en llamas

La oxitocina es la hormona clave para inducir la liberación pulsátil de prostaglandina F2α (PGF2α) hacia el final del ciclo estral en varias especies de animales domésticos, ocurriendo pulsos de oxitocina en forma concomitante con la liberación de PGF2α. Un estudio realizado en camellos ha reportado que la administración de una inyección de oxitocina al momento de la luteólisis no es eficaz para provocar una mayor liberación de PGF2α. Por otro lado, en llamas no se han observado cambios en la expresión endometrial del receptor a oxitocina durante la fase luteal. Sin embargo, no se han realizado estudios que evalúen si inyecciones repetidas de oxitocina logran adelantar el proceso de luteólisis en llamas. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la administración endovenosa de oxitocina durante la fase luteal tardía en esta especie. Se utilizaron 10 hembras, las cuales fueron ecografiadas diariamente hasta la detección de un folículo ≥ 8 mm, momento en que se les indujo la ovulación con una dosis de Buserelina (8,4 μg, Receptal®, Intervet, Argentina). Posteriormente, se dividieron aleatoriamente en dos grupos: un grupo control (GC; n=5), que no recibió ningún tratamiento adicional y un grupo tratado (GT; n=5) el cual recibió una inyección endovenosa de oxitocina (40 UI, Oxitocina, Tecnofarm®, Argentina) cada 12 h desde el día 6 hasta el día 8 post inducción de la ovulación. Diariamente, se obtuvieron muestras de sangre desde el día 0 hasta el día 12 post inyección de Buserelina para la posterior determinación de las concentraciones plasmáticas de progesterona por RIA. El análisis estadístico se realizó a través del programa InfoStat, el tamaño folicular al inicio del tratamiento se comparó a través de un Test t de Student y las concentraciones plasmáticas de progesterona entre ambos grupos a través del Test Kruskal-Wallis. El diámetro promedio del folículo mayor al momento de la inyección de Buserelina fue similar entre los grupos (GC: 8,9 ± 0,2 y GT: 8,9 ± 0,3 mm; P = 0,23). La ovulación se registró en el 100 % de los animales. En los animales del GC, las concentraciones plasmáticas de progesterona comenzaron a elevarse al día 4, alcanzaron un pico entre los días 8 y 9 y se observaron nuevamente concentraciones basales entre los días 11 y 12 post inducción de la ovulación. En el grupo tratado el patrón de concentraciones plasmáticas de progesterona fue similar al del grupo control, no evidenciándose un efecto del tratamiento (P = 0,64). Se concluyó que inyecciones de oxitocina cada 12 horas desde el día 6 al día 8 post inducción de la ovulación no es capaces de inducir una luteólisis prematura o una disminución en las concentraciones plasmáticas de progesterona, no pudiéndose establecer el rol de dicha hormona en el inicio de la descarga de PGF2α durante el proceso de luteólisis.Fil: Bianchi, Carolina Paula. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Gallelli, Maria Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Benavente, Micaela Andrea. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Aba, M. A.. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaVI Jornadas Internacionales del INITRACiudad Autónoma de Buenos AiresArgentinaUniversidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Anima

Receptor a estrógenos beta en carcinomas mamarios caninos: su relación con el grado histológico de malignidad

Los tumores mamarios representan el tipo tumoral más frecuente en la hembra canina, siendo aproximadamente la mitad de ellos de naturaleza maligna. Las hormonas esteroides sexuales (estrógenos y progesterona) son consideradas el principal factor de riesgo para su desarrollo (Misdorp, 2002). Ambas hormonas ejercen sus efectos a través de su unión a receptores nucleares, y para el caso de los estrógenos, existen dos subtipos de receptores, denominados alfa (REa) y beta (REb). Su presencia ha sido demostrada en mamas caninas normales y neoplásicas. Estudios previos indican que la expresión del REα en tumores mamarios malignos se asocia con indicadores de buen pronóstico, como tamaño tumoral menor a 3 cm, y ausencia de metástasis ganglionar y a distancia (Nieto y col., 2000). Por su parte, la significancia de la expresión del RE beta es actualmente incierta, existiendo controversias al respecto. Un estudio reporta una mayor expresión del RE beta en tumores benignos que en los malignos (Martín de las Mulas y col., 2004) mientras que otros autores no han encontrado diferencias significativas entre ambos tipos tumorales (Port Louis y col., 2012). Asimismo, en los tumores malignos, se desconoce la posible relación entre la expresión de este receptor y los parámetros clínicos y/o patológicos de valor pronóstico para el animal.Objetivo: Evaluar la expresión del RE beta en tumores mamarios malignos caninos y determinar si existen diferencias significativas en su expresión entre diferentes Grados Histológicos de Malignidad (GHM).Diseño experimental: Se realizó un diseño no experimental, de tipo descriptivo.Materiales y métodos: Se obtuvieron 20 muestras de tumores caninos luego de la mastectomía, los cuales fueron diagnosticados por histología como carcinomas simples. La determinación del GHM se realizó a través del sistema Ellston y Ellis (Nottingham) utilizado en la graduación del cáncer mamario humano. Este sistema tiene en cuenta tres características morfológicas (formación de túbulos, pleomorfismo nuclear y recuento mitótico) y permite clasificar a los carcinomas en Grado I (bien diferenciado), Grado II (moderadamente diferenciado) o Grado III (pobremente diferenciado). A mayor GHM, peor es el pronóstico de vida para el paciente. Asimismo, las muestras fueron procesadas usando la técnica inmunohistoquímica avidina-biotina-peroxidasa para la determinación del REβ. Se utilizó un anticuerpo primario específico para el RE beta (Novocastra, Clone EMR02, Leyca Biosystems, UK). La expresión del mismo se evaluó en las células epiteliales tumorales, determinando el porcentaje de células positivas. El análisis de imagen se realizó por dos observadores independientes y se analizaron 10 campos por muestra con un aumento de 1000X. Para el análisis estadístico, se utilizó una prueba de Chi-cuadrado de Pearson. Se consideraron diferencias estadísticamente significativas con p menor o igual 0,05.Resultados: De los 20 carcinomas analizados, 9 presentaron GHM I, 6 fueron GHM II, y 5 fueron Grado III. Con respecto a la expresión inmunohistoquímica del REβ, en los tumores de Grado I se expresó en un 13%, en los de Grado II se expresó en un 20%, y en aquellos de Grado III, la expresión fue del 31% (p ≤ 0,05) (Figura 1).Conclusiones y relevancia clínica: La mayor expresión del RE beta se observó en aquellos carcinomas que presentaron GHM III. Este dato coincide con un reporte previo del grupo, en el que la expresión del RE beta fue más frecuente en aquellos tumores malignos que presentaban indicadores de pronóstico desfavorable (estadio clínico IV y afección de linfonodos regionales) (Benavente y col., 2015). A futuro, sería de utilidad realizar estudios con un mayor número de casos, y que tengan en cuenta la sobrevida del paciente, para conocer el verdadero valor pronóstico del RE beta en cáncer mamario canino.Fil: Benavente, Micaela Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Bianchi, Carolina Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Denzoin Vulcano, L. A.. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Fisiopatología; ArgentinaFil: Aba, Marcelo Alfredo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaII Congreso Internacional de Medicina de Animales de CompañiaTandilArgentinaUniversidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinaria

Oestrogen, Progesterone and Oxytocin Receptors and COX-2 Expression in Endometrial Biopsy Samples from the Induction of Ovulation to Luteolysis in Llamas (Lama glama)

Endometrial expression of oestrogen (ERa), progesterone (PR) and oxytocin receptor (OR) and cyclooxygenase-2 (COX-2) was evaluated from the induction of ovulation to luteolysis in llamas. Ovarian activity was daily assessed by ultrasonography in five females. Ovulation was induced immediately after the detection of an ovulatory follicle by a GnRH injection (Day 0). Endometrial samples were obtained by transcervical biopsies from the left and right horns on day 0 and days 4, 8, 10 and 12 post-GnRH. Blood samples were collected daily for progesterone and estradiol-17b determinations by RIA. An immunohistochemical technique was used to study receptors population and COX-2 expression which were then evaluated by two independent observers. The expression of ERa and PR was highest on day 0 in the luminal epithelium and stroma in association with high plasma estradiol-17b concentrations. Thereafter, a decrease in ERa population was registered on day 4 and a new increase of its expression was observed between days 8 and 12 in those cell types. Conversely, PR population was gradually down-regulated until its lowest expression was reached on day 10 post-GnRH in the luminal epithelium. Content of OR was similar throughout the study in all cell types. The expression of COX-2 was highest from day 8 to 12 post-GnRH in the luminal epithelium, in relation to the time of maximal PGF2a release. Both steroid receptors populations and COX-2 expression were similar between horns. Meanwhile, OR expression was higher in the right than in the left uterine horn. In summary, this study showed that the loss of endometrium sensitivity to progesterone by days 8?10 post-induction of ovulation and the concomitant increase of COX-2 expression could play a key role in the mechanism of luteolysis and somehow be related to the short corpus luteum lifespan of llamas.Fil: Bianchi, Carolina Paula. Consejo Nacional de Invest.cientif.y Tecnicas. Ctro Cientifico Tecnologico Conicet - Tandil. Centro de Investigacion Veterinaria de Tandil;Fil: Meikle, A.. Universidad de la República de Uruguay; Uruguay;Fil: Alvarez, M.A.. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires.. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Fisiopatologia. Laboratorio de Endocrinologia; Argentina;Fil: Benavente, Micaela Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico - CONICET- Tandil. Centro de Investigacion Veterinaria de Tandil; Argentina;Fil: Cavilla, María Verónica. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires.. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Fisiopatologia. Laboratorio de Endocrinologia; Argentina;Fil: Rodriguez, E.. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires.. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina;Fil: Aba, Marcelo Alfredo. Consejo Nacional de Invest.cientif.y Tecnicas. Ctro Cientifico Tecnologico Conicet - Tandil. Centro de Investigacion Veterinaria de Tandil

Estrogen and Progesterone Receptors and COX-2 Expression in Endometrial Biopsy Samples During Maternal Recognition of Pregnancy in Llamas (Lama glama)

Endometrial expression of oestrogen receptor-a (ERa),progesterone receptor (PR) and cyclooxigenase-2 (COX-2)was evaluated in non-pregnant and pregnant llamas during theperiod when luteolysis/maternal recognition of pregnancy isexpected to occur. Females (n = 28) were divided into twogroups: non-pregnant llamas were induced to ovulate with aBuserelin injection, and endometrial biopsies were obtained onday 8 (n = 5) or 12 (n = 5) post-induction of ovulation.Animals of the pregnant group (n = 18) were mated with afertile male. Pregnancy was confirmed by the visualization ofthe embryo collected by transcervical flushing in 5 of 9 animalson day 8 post-mating and by progesterone profile on day 12post-mating in 4 of 9 animals, when endometrial biopsies wereobtained. An immunohistochemical technique was used toevaluate receptors population and COX-2 expression.Pregnant llamas showed a higher percentage of positive cellsand stronger intensity for ERa than for non-pregnant llamasin stroma on day 8 and in the luminal epithelium on day 12post-induction of ovulation, while a deep decrease in endometrialPR population was reported in pregnant llamas on thatday in luminal and glandular epithelia and stroma. In theluminal epithelium, COX-2 expression was lower in pregnantthan in non-pregnant animals. Briefly, the increase of ERa inpregnant llamas gives further support to the hypothesis thatoestrogens are involved in the mechanism of maternal recognitionof pregnancy. Endometrial PR decrease in pregnantllamas might be a necessary event to allow the expression ofproteins involved in conceptus attachment, a mechanismwidely accepted in other species. Moreover, embryo seems toattenuate maternal PGF2a secretion during early pregnancy bydecreasing the endometrial expression of COX-2 in the luminalepithelium of pregnant llamas.Fil: Bianchi, Carolina Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Meikle, A.. Universidad del Uruguay; UruguayFil: Benavente, Micaela Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Álvarez, M.. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires.. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Fisiopatologia. Laboratorio de Endocrinologia; ArgentinaFil: Trasorras, Virginia Luz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Miragaya, Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Rodriguez, E.. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires.. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Fisiopatologia. Laboratorio de Endocrinologia; ArgentinaFil: Aba, Marcelo Alfredo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; Argentin