Molekularbiologisch-biochemische Untersuchungen des Plasmodium falciparum Chloroquin Resistenz Transporters mittels Expression in Xenopus laevis Oozyten

Malaria ist mit einer Mortalitätsrate von über einer Million Menschen pro Jahr, wovon die meisten Kinder unter fünf Jahren sind, nach wie vor eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten weltweit. Aufgrund der sich immer weiter ausbreitenden Resistenzen des Erregers Plasmodium falciparum gegen Malaria Medikamente wird der Kampf gegen die Krankheit zunehmend schwerer. Das einstmals mit hoher Effizienz und geringen Nebenwirkungen einsetzbare Chloroquin (CQ) beispielsweise verlor in den vergangenen Jahrzehnten immer mehr an Bedeutung. Ebenso verhält es sich für Chinin (QN). Wie aber kommt es zur Ausbildung dieser Resistenzen? Das in der Nahrungsvakuole des Parasiten lokalisierte transmembrane Protein PfCRT (Plasmodium falciparum Chloroquin Resistenz Transporter) spielt hierbei eine entscheidende Rolle. Es konnte nachgewiesen werden, dass bestimmte Punktmutationen innerhalb dieses Proteins zu einem gesteigerten Efflux von CQ aus der Nahrungsvakuole herausführen. Die Schlüsselrolle hierbei kommt der Aminosäure an Position 76 zu. Beim CQ sensitiven Plasmodium falciparum Stamm HB3 befindet sich an dieser Position ein Lysin (K76), wohingegen beim CQ resistenten Stamm Dd2 ein Threonin (T76) an dieser Stelle festzustellen ist. Darüber hinaus gibt es noch weitere Polymorphismen in PfCRT, welche Einfluss auf dessen Funktionalität nehmen. CQ und QN sind Substrate von PfCRT. Ob die Substratbindetasche in PfCRT für CQ und QN dieselbe ist, ob sie teilweise überlappt oder ob jedes Substrat in einer eigenständigen Bindetasche bindet ist noch unklar. Um dies zu untersuchen, wurde PfCRTDd2 in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert, welche anschließend für Aufnahmestudien mit CQ und QN verwendet wurden. Zunächst wurden konzentrationsabhängige Aufnahmestudien mit CQ unter Zugabe verschiedener Konzentrationen von QN durchgeführt. Anschließend wurden die Versuchsbedingungen umgekehrt und die Konzentrationsabhängige Aufnahme von QN bei verschiedenen Konzentrationen von CQ gemessen. Die in diesen Versuchen erzielten Ergebnisse sprechen für eine partiell gemischte (hyperbolische) Inhibierung, was wiederum auf unterschiedliche Bindetasche für das jeweilige Substrat hindeutet. Um zu untersuchen, wie sich Mutationen an der bedeutenden Position 76 auf die Transporteigenschaften von PfCRT auswirken, wurde T76 in PfCRTDd2 jeweils durch die 19 restlichen proteinogenen Aminosäuren ersetzt (T76X) und ebenfalls in Oozyten von X. laevis exprimiert. Die im Anschluss in den Oozyten gemessene Aufnahme von CQ, QN und dessen Isomers Chinidin (QD) zeigt, dass Aminosäuren mit positiv geladener Seitenkette (Lysin, Arginin und Histidin) an Position 76 die entsprechende PfCRT vermittelte Akkumulation aller drei Substrate unterbinden. Diese Akkumulation wird auch durch die Substitution von T76 durch Prolin (T76P) unterbunden. Allerdings ist der Effekt hier sehr wahrscheinlich auf die cyclische Form der Seitenkette des Prolins zurückzuführen (→ „Helixbrecher“). Anhand einer Auswahl von PfCRT Dd2T76X Varianten ließ sich ebenfalls durch Aufnahmestudien mit CQ in X. laevis Oozyten ein direkter Einfluss auf die Transportkinetik von PfCRTDd2 nachweisen. Durch gezielte Mutagenese wurde weiterhin eine Reihe von PfCRT Varianten mit Mutationen an spezifischen Positionen in Oozyten exprimiert und ebenfalls für Aufnahmestudien verwendet. Die Intention dahinter war, den Einfluss der mutierten Aminosäuren auf die Funktionalität von PfCRT zu prüfen. Die daraus erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass außer T76 noch weitere Aminosäuren eine mehr oder weniger wichtige Rolle für den Substrattransport spielen. Vor allem E75 hat einen entscheidenden Einfluss auf den Transport, insbesondere für QN und QD. Außerdem wirken sich verschiedene Kombinationen von Mutationen in PfCRT auf die Aufnahmerate und Substratspezifität aus, was durch einen weiteren Kompetitionsversuch mit QN und CQ bestätigt werden konnte. In diesem Versuch wurden die PfCRT Variante des P. falciparum Stammes Ecu1110 und eine chimäre PfCRT Variante (die erste Hälfte des Proteins von PfCRTDd2 und die zweite Hälfte von PfCRTEcu1110) mit PfCRTDd2 bezüglich der CQ Aufnahme in Anwesenheit von QN verglichen. Basierend auf diese Daten wurden Zusammenhänge zwischen Mutationen in PfCRT und damit einhergehende Veränderungen in dessen Transportaktivität beobachtet und in einem Gesamtkontext veranschaulicht

Multiple drugs compete for transport via the Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter at distinct but interdependent sites

Mutations in the "chloroquine resistance transporter" (PfCRT) are a major determinant of drug resistance in the malaria parasite Plasmodium falciparum. We have previously shown that mutant PfCRT transports the antimalarial drug chloroquine away from its target, whereas the wild-type form of PfCRT does not. However, little is understood about the transport of other drugs via PfCRT or the mechanism by which PfCRT recognizes different substrates. Here we show that mutant PfCRT also transports quinine, quinidine, and verapamil, indicating that the protein behaves as a multidrug resistance carrier. Detailed kinetic analyses revealed that chloroquine and quinine compete for transport via PfCRT in a manner that is consistent with mixed-type inhibition. Moreover, our analyses suggest that PfCRT accepts chloroquine and quinine at distinct but antagonistically interacting sites. We also found verapamil to be a partial mixed-type inhibitor of chloroquine transport via PfCRT, further supporting the idea that PfCRT possesses multiple substratebinding sites. Our findings provide new mechanistic insights into the workings of PfCRT, which could be exploited to design potent inhibitors of this key mediator of drug resistance

Laparoscopic, three-port and SILS cholecystectomy: a retrospective study.

Introduction. The aim of this study was to compare the results of classic laparoscopic, three-port and SILS cholecystectomy. Materials and methods. We conducted a retrospective study of da- ta collected between January 2010 and December 2012 pertaining to 159 selected patients with symptomatic gallstones. 57 underwent lapa- roscopic cholecystectomy, 51 three-port cholecystectomy and 48 SILS cholecystectomy. We then compared the groups with respect to mean ope- rating time, intraoperative complications, postoperative pain, duration of hospitalization and final aesthetic result. Introduction The first laparoscopic cholecystectomy was carried out in 1987 in France by Philippe Mouret (1). The progressive evolution of the technique has led this procedure to be- come the gold standard in the treatment of symptoma- tic gallstones (2). As the technology improved, many sur- geons began to reduce the number and size of the ports with the aim of achieving ever lower invasiveness, con- sequently reducing trauma and postoperative pain and improving the cosmetic results. There was thus a pro- Results. The mean operating time was significantly higher in the SILS cholecystectomy group (93 minutes) than in the other two groups. There were no intraoperative complications. There were no significant differences in the duration of hospitalization among the three groups. Patients in the SILS cholecystectomy group reported significantly less pain 3, 6 and 12 hours after surgery. The aesthetic results at 1 and 6 months’ follow-up were also decidedly better. Conclusions. On the basis of this study, SILS cholecystectomy is a feasible, safe procedure. In any case, it should be used in selected patients only and carried out by a dedicated team with strong experience in laparoscopy. The main advantages of this technique are a reduction in post-operative pain and improved aesthetic result, at the price, howe- ver, of its greater technical difficulty and longer operating times. Future studies are in any case necessary to evaluate any other benefits of this method

Diverse mutational pathways converge on saturable chloroquine transport via the malaria parasite's chloroquine resistance transporter

Mutations in the chloroquine resistance transporter (PfCRT) are the primary determinant of chloroquine (CQ) resistance in the malaria parasite Plasmodium falciparum. A number of distinct PfCRT haplotypes, containing between 4 and 10 mutations, have give

Stem Cells: Innovative Therapeutic Options for Neurodegenerative Diseases?

Neurodegenerative diseases are characterized by the progressive loss of structure and/or function of both neurons and glial cells, leading to different degrees of pathology and loss of cognition. The hypothesis of circuit reconstruction in the damaged brain via direct cell replacement has been pursued extensively so far. In this context, stem cells represent a useful option since they provide tissue restoration through the substitution of damaged neuronal cells with exogenous stem cells and create a neuro-protective environment through the release of bioactive molecules for healthy neurons, as well. These peculiar properties of stem cells are opening to potential therapeutic strategies for the treatment of severe neurodegenerative disorders, for which the absence of effective treatment options leads to an increasingly socio-economic burden. Currently, the introduction of new technologies in the field of stem cells and the implementation of alternative cell tissues sources are pointing to exciting frontiers in this area of research. Here, we provide an update of the current knowledge about source and administration routes of stem cells, and review light and shadows of cells replacement therapy for the treatment of the three main neurodegenerative disorders (Amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson’s, and Alzheimer’s disease)