Clonagem e expressão heteróloga de transportadores de xilose em linhagem de Saccharomyces cerevisiae recombinante

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015.Na produção de etanol de segunda geração o transporte dos açúcares para o interior da levedura Saccharomyces cerevisiae constitui um passo limitante, principalmente no caso da pentose xilose, o segundo açúcar mais abundante na biomassa lignocelulósica. Para caracterizar o efeito de diferentes transportadores na fermentação de xilose, neste trabalho foi utilizada uma linhagem hxt-null de S. cerevisiae (hxt1-hxt7? e gal2?), mas capaz de metabolizar xilose devido à sobre-expressão dos genes XYL1, XYL2 e XKS1 que codificam as enzimas xilose redutase, xilitol desidrogenase e xilulocinase, respectivamente. Essa linhagem hxt-null foi utilizada para expressar transportadores de S. cerevisiae e de leveduras fermentadoras de xilose Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae e Spathaspora passalidarum. Os resultados indicam que nenhuma das permeases de S. cerevisiae analisadas (Hxt1, Hxt2, Hxt5 e Hxt7) possui propriedades adequadas para captação de xilose, quando esta é a única fonte de carbono ou em misturas de xilose/glicose. Uma biblioteca genômica de S. stipitis foi inserida na linhagem hxt-null, resultando na clonagem de três permeases que realizam o transporte de xilose: o já conhecido transportador Xut1 e duas novas permeases (Hxt2.6 e Qup2) que ainda não tinham sido caracterizadas nessa levedura. No entanto, nenhuma dessas proteínas mostrou-se específica para xilose, pois também captam hexoses presentes no meio. O genoma sequenciado das leveduras S. arborariae e S. passalidarum foi analisado na busca por genes com homologia à transportadores de xilose, e três genes selecionados foram clonados e expressos na linhagem hxt-null. Desses, apenas a permease Sut1 de S. passalidarum realizou transporte de xilose (além de outras hexoses) e, quando o gene HXT4 de S. arborariae era expresso, não houve consumo ou fermentação de nenhum dos açúcares testados. Outra permease dessa levedura (Get1) apresentou uma característica peculiar, ocorrendo a captação de xilose apenas quando maltose ou outras fontes de carbono estavam presentes. Os resultados indicam que a caracterização de novos transportadores de açúcares presentes no genoma de leveduras fermentadoras de xilose é necessária para desenvolver novas estratégias para otimizar a fermentação de hidrolisados lignocelulósicos por linhagens de S. cerevisiae recombinantes.Abstract : The internalization of sugars in Saccharomyces cerevisiae during second generation ethanol production is a limiting step, primarily because of xylose, the second most abundant sugar in lignocellulosic biomass. To typify the influence of different transporter in the xylose fermentation, in this work it was used a hxt-null S. cerevisiae strain, deleted in its main hexoses permeases (hxt1-hxt7? e gal2?), but capable of metabolize xylose, due to the overexpression of genes XYL1, XYL2 and XKS1, that code of the enzymes xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulokinase. This hxt-null strain was used to express transporters from the genome of S. cerevisiae and from xylose-fermenting yeasts Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae and Spathaspora passalidarum. The results show that none of the S. cerevisiae permeases analyzed (Hxt1, Hxt2, Hxt5 and Hxt7) had properties suitable for xylose fermentation or xylose/glucose mixtures. In order to obtain new transporters, a genomic library from S. stipitis was transformed into the hxt-null strain, which resulted in cloning three permeases that allowed growth and fermentation of xylose: the already known Xut1, and two new permeases (Hxt2.6 and Qup2) that were not characterized before in this yeast. However, none of these proteins was specific for xylose, since they also allowed efficient fermentation of hexoses in the hxt-null strain. Regarding S. arborariae and S. passalidarum, both yeasts had their genome sequenced and were used to search genes homologues to xylose transporters. Three gene selected were cloned and expressed in the hxt-null S. cerevisiae strain. Of these permeases coded, only Sut1 from S. passalidarum restored xylose (and hexoses) fermentation, and when HXT4 from S. arborariae was expressed, there were no uptake or fermentation of any sugar tested. Another permease from this yeast (Get1) had a peculiar characteristic: it consumed xylose only in co-fermentation, with maltose or other carbon source. The results indicate that the characterization of new sugar transporters present in the genome of xilose-fermenting yeasts is needed to develop new strategies to optimize lignocellulosic hydrolisates fermentations by recombinants S. cerevisiae strains

Construction of Saccharomyces cerevisiae recombinant strains overexpressing pentoses transporters.

A conversão da biomassa para produção de etanol celulósico só é viável se a fração hemicelulósica e celulósica for utilizada no processo industrial. Para obtenção de leveduras capazes de produzir etanol a partir de pentoses, a captação desses açúcares é muito estudada, sendo que diversos autores concluíram que a interiorização do substrato é uma etapa limitante para a produção de etanol. Neste trabalho foram isoladas leveduras da biodiversidade brasileira capazes de fermentar xilose. Foram construídos cassetes de expressão dos genes HXT5 e HXT7 de S. cerevisisae e analisados os consumos de glicose e xilose e a produção de etanol, em condições de aeração e de restrição de oxigênio. Análises qualitativas e quantitativas mostraram que os clones recombinantes foram capazes de consumir mais rapidamente xilose e glicose. Entretanto, isto não resultou no aumento de produção de biomassa ou de etanol a partir de xilose, sugerindo que a baixa expressão dos genes endógenos da rota de utilização deste açúcar foi determinante para seu acúmulo intracelular.The biomass conversion for industrial cellulosic ethanol production is feasible only if all hemicellulosic and cellulosic fractions are exploited in the process. In the aim to have yeasts capable of producing ethanol from pentoses, the transport of these sugars is very much studied, and many authors have concluded that the utilization of xylose is a limiting step for ethanol production. In this work were isolated yeast from Brazilian biodiversity capable of fermenting xylose. It was built expression cassettes of the genes HXT5 and HXT7 from S. cerevisiae and analyzed the consumptions of glucose and xylose and the ethanol production in aerated and oxygen limited conditions. Qualitative and quantitative analysis showed that the recombinant yeasts were capable of consuming more rapidly the two sugars. However, it didn´t result in greater production of biomassa or of ethanol from xylose, suggesting that the low expression of the natural genes in the xylose utilization pathway was determinant for the intracellular accumulation of this pentose