Target analysis for the adipokinetic hormone of 'Daphnia'

Members of the red pigment-concentrating hormone (RPCH)/adipokinetic hormone (AKH) peptide family are involved in many physiological, developmental and behavioral processes in insects, and pigment translocation in decapod crustaceans. In the branchiopod Daphnia pulex, a preprohormone for RPCH/AKH is encoded in the genome and the mature peptide, Dappu-RPCH (pQVNFSTSW-amide) is predicted from the preprohormone. Here, we have developed a method to measure the peptide in hemolymph of Daphnia. It uses reversed-phase liquid chromatography and high-resolution mass spectrometry of the singly- and the doubly-charged peptide ions, respectively, and their gas phase fragmentation for target identification. Pilot studies were conducted with synthetic Dappu-RPCH and the method was sensitive at the low fmol level without biological matrix. When hemolymph samples were however spiked with known amounts of the synthetic peptide, much less peptide was recovered and detected. Thus far, with our method of peptide purification, the endogenous peptide was not detectable in hemolymph of Daphnia where AKH titres of 1 fmol/µl hemolymph are expected.Die Mitglieder der Familie des rotes-Pigment-konzentrierenden (RPCH) / adipokinetischen Hormons sind in viele physiologische und Verhaltens-Prozesse von Insekten sowie die Pigment-Translokation in Zehnfußkrebsen involviert. Im Genom des Kiemenfußkrebses Daphnia pulex ist ein Preprohormon für RPCH/AKH kodiert, nach dem das voll ausgebildete Peptid, Dappu-RPCH (pQVNFSTSW-amide), vorausgesagt wird. Wir haben eine Methode entwickelt, um das Peptid in der Hämolymphe von Daphnia nachzuweisen. Sie verwendet Umkehrphasen-Flüssigchromatographie und hochauflösende Massenspektrometrie des einfach und des zweifach geladenen Peptidions und deren Gasphasenfragmentierung zur Target-Identifizierung. Pilotstudien wurden mit synthetischem Dappu-RPCH durchgeführt. Die Methode war empfindlich auf dem niedrigen fmol-Level ohne biologische Matrix. Wurde jedoch die Hämolymphe mit bekannten Mengen des synthetischen Peptids versetzt, wurde viel weniger Peptid gemessen. Mit unserer bisherigen Methode zur Peptidreinigung konnte daher noch kein endogenes Peptid in der Hämolymphe von Daphnia bestimmt werden, wo AKH-Titer von 1 fmol/µl erwartet werden