Transzcelluláris bikarbonát szekréció és intracelluláris pH reguláció polarizált epitheliás sejtekben = Transcellular bicarbonate secretion and intracellular pH regulation on polarized epithelial cells

Kutatásunk célja polarizált epitheliális sejtek elektrolit és folyadékszekréciójának molekuláris szintű vizsgálata volt. Jól differenciált hasnyálmirigy duktusz Capan-1 és HPAF, valamint nyálmirigy acinus ParC10 és SMIE sejtvonalakat vizsgáltunk molekuláris és funkcionális eszközrendszer alkalmazásával. Polarizált sejttenyészeteket hoztunk létre permeábilis membránon, és vizsgáltuk génexpressziós mintázatukat RT-PCR-rel, anionszekréciójukat Ussing kamrás módszerrel és intracelluláris pH-szabályozásukat mikrofluorometriás pH-mérés segítségével. A vízszekrécióért felelős mechanizmusokat szöveti immunhisztokémiai módszerekkel tanulmányoztuk. Kimutattuk Capan-1, HPAF és Par-C10 sejtekben az NBC, NHE1, NKCC1, CFTR mRNS-ek expresszióját. Igazoltuk, hogy patkány és emberi hasnyálmirigyben koexpresszálódik az AQP1 és AQP5 csatorna az intraloburális duktuszok apikális felszínén. Ussing-kamrás kísérleteink során bizonyítottuk, hogy az HPAF és Par-C10 sejtvonalak képesek vektoriális anion szekrécióra, és ez gátolható az NKCC gátlásával. Sikerült igazolnunk, hogy a Capan-1, HPAF és Par-C10 sejtvonalakban a HCO3- utánpótlását a bazolaterálisan elhelyezkedő NBC és NHE együttesen szolgáltatják. Eredményeink szerint ParC10 sejtek bazolaterális és apikális felszínén is találhatóak anion-kicserélők. Az általunk jellemzett modellrendszerek jól alkalmazhatók a továbbiakban a humán külső elválasztású mirigyek folyadék- és elektrolit szekréció rendellenességeinek modellezésére. | We studied the molecular mechanisms of the electrolyte and fluid secretion of polarized epithelial cells. We have used well differentiated Capan-1 and HPAF pancreas ductal and Par-C10 and SMIE salivary acinar cell lines for molecular and functional experiments. The cells were seeded on permeable support and formed polarized cultures. RT-PCR tests were taken to examine the gene expression of the cells. We have investigated the anion secretion with Ussing chamber, and intracellular pH with microfluorometric measurements. The mechanisms responsible for transcellular water secretion were studied by tissue immunohystochemistry. We have shown the Capan-1, HPAF and Par-C10 cells express the mRNA of NBC, NHE1, NKCC1 and CFTR. We have demonstrated that AQP1 and AQP5 aquaporin water channels colocalize on the apical membrane of rat and human pancreas intercalated ductal cells. With Ussing-chamber experiments it was detected that the HPAF and Par-C10 cells are capable of vectorial anion secretion and that this secretion can be blocked by the inhibition of NKCC. We could demonstrate that the HCO3- influx happens through the basolateral NHE and NBC transporters in Capan-1, HPAF and Par-C10 cells. Our results show that anion exchangers work in both the basolateral and apical membranes of Par-C10 cells. The characterized polarized cell systems are suitable model systems for examining the fluid- and electrolyte secretory transport function disorders of human exocrine glands

Fogeredetű posztnatális őssejtek izolálása és jellemzése = Isolation and characterisation of postnatal stem cells of dental origin

Kutatásainkhoz a K61543 kutatási pályázatmellé elnyertük a IN67250 nemzetközi kiegészítő támogatást is, így beszámolónk ezek összefoglaló zárójelentése. Vizsgálataink célja emberi fogbélből és parodontális ligamentumból származó őssejtek izolálása és jellemzése, in vitro modell-rendszerek és eljárások kidolgozása a fogeredetű, és így potenciálisan a fogak és a parodontális szövetek részleges vagy teljes regenerációjára felhasználható őssejtek azonosítására, izolálására és fejlődési, differenciálódási képességeik meghatározására, illetve ectodermális sejtekkel való kölcsönhatásaik jellemzésére. Munkánk során emberi fogak pulpájából (dental pulp stem cell=DPSC) és a parodontális ligamentumból (periodontal ligament stem cells=PDLSC) illetve emberi nyálmirigyekből (PTHSG) preparáltunk pluripotens őssejteket tartalmazó sejtkultúrákat. Ezen kultúrákat molekuláris és sejtbiológiai módszerekkel jellemeztük, a sejteket különböző irányú differenciálódásra / transdifferenciálódásra bírtuk. Az osteogén differenciálódás mellett ki kell emelnünk mind a DPSC, mind a PDLSC sejtek képességét a neuronális differenciálódásra az általunk kidolgozott három lépésből álló protokoll mellett. Fentieken túl egy új állatkísérletes tesztrendszert dolgoztunk ki az osseointegráció, illetve a parodontális ligamentum és a fogbél regenerációjának tanulmányozására. Mindezek megalapozzák további ilyen irányú kutatásainkat, az emberi fogeredetű sejtek in vivo regenerációs alkalmazásának kidolgozására. | The originally supported K61543 research grant received additional support by IN67250, which is a supplementary international extension of the same project. Therefore, this is a joint report of the twin grants. The purpose of our study was to isolate and characterize human stem cells from dental pulp and periodontal ligament, to develop in vitro model systems and processes, for identification of stem cells, which have the potential for full or partial regeneration dental and periodontal tissues. On the course of our work we prepared cultures containing pluripotent postnatal stem cells from the dental pulp (dental pulp stem cell=DPSC), from the periodontal ligament (periodontal ligament stem cells=PDLSC), and from the salivary glands (PTHSG). We characterized these cultures and developed methods for their differentiation / transdifferentiation in vitro. Besides the osteogenic differentiation we must highlight the potency of both DPSC and PDLSC cells for neuronal differentiation when our newly developed three step protocol is used. Moreover we also developed and in vivo animal test model for studying osseointegration, periodontal and pulp regeneration. These results will give the foundation of our future work towards the application of human stem cells of dental origin in biological regeneration of damaged tissues

Fogeredetű őssejtek izolálása és jellemzése = Isolation and characterisation of postnatal stem cells of dental origin

Kutatásainkhoz a K61543 kutatási pályázatmellé elnyertük a IN67250 nemzetközi kiegészítő támogatást is, így beszámolónk ezek összefoglaló zárójelentése. Vizsgálataink célja emberi fogbélből és parodontális ligamentumból származó őssejtek izolálása és jellemzése, in vitro modell-rendszerek és eljárások kidolgozása a fogeredetű, és így potenciálisan a fogak és a parodontális szövetek részleges vagy teljes regenerációjára felhasználható őssejtek azonosítására, izolálására és fejlődési, differenciálódási képességeik meghatározására, illetve ectodermális sejtekkel való kölcsönhatásaik jellemzésére. Munkánk során emberi fogak pulpájából (dental pulp stem cell=DPSC) és a parodontális ligamentumból (periodontal ligament stem cells=PDLSC) illetve emberi nyálmirigyekből (PTHSG) preparáltunk pluripotens őssejteket tartalmazó sejtkultúrákat. Ezen kultúrákat molekuláris és sejtbiológiai módszerekkel jellemeztük, a sejteket különböző irányú differenciálódásra / transdifferenciálódásra bírtuk. Az osteogén differenciálódás mellett ki kell emelnünk mind a DPSC, mind a PDLSC sejtek képességét a neuronális differenciálódásra az általunk kidolgozott három lépésből álló protokoll mellett. Fentieken túl egy új állatkísérletes tesztrendszert dolgoztunk ki az osseointegráció, illetve a parodontális ligamentum és a fogbél regenerációjának tanulmányozására. Mindezek megalapozzák további ilyen irányú kutatásainkat, az emberi fogeredetű sejtek in vivo regenerációs alkalmazásának kidolgozására. | The originally supported K61543 research grant received additional support by IN67250, which is a supplementary international extension of the same project. Therefore, this is a joint report of the twin grants. The purpose of our study was to isolate and characterize human stem cells from dental pulp and periodontal ligament, to develop in vitro model systems and processes, for identification of stem cells, which have the potential for full or partial regeneration dental and periodontal tissues. On the course of our work we prepared cultures containing pluripotent postnatal stem cells from the dental pulp (dental pulp stem cell=DPSC), from the periodontal ligament (periodontal ligament stem cells=PDLSC), and from the salivary glands (PTHSG). We characterized these cultures and developed methods for their differentiation / transdifferentiation in vitro. Besides the osteogenic differentiation we must highlight the potency of both DPSC and PDLSC cells for neuronal differentiation when our newly developed three step protocol is used. Moreover we also developed and in vivo animal test model for studying osseointegration, periodontal and pulp regeneration. These results will give the foundation of our future work towards the application of human stem cells of dental origin in biological regeneration of damaged tissues

Role of anion exchangers in Cl- and HCO3- secretion by the human airway epithelial cell line Calu-3

Despite the importance of airway surface liquid pH in the lung's defenses against infection, the mechanism of airway HCO3- secretion remains unclear. Our aim was to assess the contribution of apical and basolateral Cl-/HCO3- exchangers to Cl- and HCO3- transport in the Calu-3 cell line, derived from human airway submucosal glands. Changes in intracellular pH (pH(i)) were measured following substitution of Cl- with gluconate. Apical Cl- substitution led to an alkalinization in forskolin-stimulated cells, indicative of Cl-/HCO3- exchange. This was unaffected by the anion exchange inhibitor DIDS but inhibited by the CFTR blocker CFTRinh-172, suggesting that the HCO3- influx might occur via CFTR, rather than a solute carrier family 26 (SLC26) exchanger, as recently proposed. The anion selectivity of the recovery process more closely resembled that of CFTR than an SLC26 exchanger, and quantitative RT-PCR showed only low levels of SLC26 exchanger transcripts relative to CFTR and anion exchanger 2 (AE2). For pHi to rise to observed values (similar to 7.8) through HCO3- entry via CFTR, the apical membrane potential must reverse to at least + 20 mV following Cl- substitution; this was confirmed by perforated-patch recordings. Substitution of basolateral Cl- evoked a DIDS-sensitive alkalinization, attributed to Cl-/HCO3- exchange via AE2. This appeared to be abolished in forskolin-stimulated cells but was unmasked by blocking apical efflux of HCO3- via CFTR. We conclude that Calu-3 cells secrete HCO3- predominantly via CFTR, and, contrary to previous reports, the basolateral anion exchanger AE2 remains active during stimulation, providing an important pathway for basolateral Cl- uptake