The influence of the microwave oven on the production of solid culture medium and quality of microbial growth

Numerous cultivation media currently exist, whether selective, non-selective, enrichment or identifi cation. However, they all have a common goal, which is the growth of microorganisms; the constitution and quality of the culture medium must favor it. For this reason, an important factor that directly affects the quality of a culture medium is its production. Thus, this article investigated the use of a microwave oven in the production of Sabouraud dextrose agar (SDA), and the microbial inactivation compared to the autoclave in a microbiology laboratory. The quality of the medium, time exposure, and sterilization potential were performed using fungal strains of Candida spp., Cryptococcus spp., Microsporum spp., and Aspergillus spp. The results showed that the advantages of the use of a microwave oven for the preparation of SDA are practicality, speed, lower energy expense, pH, and constituents preservation of the culture medium, resulting in a richer growth compared to autoclaved SDA. The multivariate analysis of digital images allowed the detection of melanoidins (brownish tone of medium), which are responsible for the negative infl uence on the microorganisms growth. This research shows the use of the microwave oven as an effi cient alternative for the production of the culture medium and maintaining their best quality

Antifungal activity and stability of fluconazole emulsion containing ionic liquids explained by intermolecular interactions

This research reports accelerated stability experiments, the evaluation of intermolecular interactions, and antifungal assays for fluconazole emulsions prepared using ultrasound (US) and magnetic stirring (MS) in the presence of ionic liquids derived from 1,n-(3-methylimidazolium-1- yl)alkane bromide ([CnMIM]Br; n = 12 or 16). The goals of the investigation are to quantify the stability, identify the forces that drive the formation and stability, and determine the antifungal activity of fluconazole-containing emulsions, and corroborate the data from our previous results that indicated that the emulsion based on [C16MIM]Br seemed to be more stable. In this study, accelerated stability experiments evidenced a considerable stability for the [C16MIM]Br emulsions at two temperatures (25 and 37 C)—the instability index increased in the following order: US40% < US20% < MS. The 1H NMR data showed that the ILs interacts differently with medium-chain triglycerides (MCT). Two distinct interaction mechanisms were also observed for [C12MIM]Br and [C16MIM]Br with fluconazole, in which the latter formed more compact mixed aggregates than the former. The result was corroborated by diffusion data, which showed that ILs suffered a decrease in diffusion in the presence of fluconazole. The antifungal assay showed that emulsions containing ILs displayed superior activity compared with fluconazole alone. The emulsions also showed potent activity in inhibiting a resistant species (C. glabrata—CG34) to FLZ. All emulsions showed weak irritant potential in HET-CAM assay

Antifungal potential of alilic selenocyanate derivatives on pathogenic Candida species

Espécies de Candida são típicos agentes de infecções oportunistas de baixa a alta complexidade. No ambiente hospitalar, por exemplo, estão geralmente relacionadas a infecções sistêmicas em pacientes imunocomprometidos com altas taxas de mortalidade. Complexando esse cenário, o uso indiscriminado de antifúngicos acarretou nos últimos anos em altos índices de resistência, o que atualmente dificulta o êxito das estratégias terapêuticas. Em vista deste panorama, estudos empenhados no desenvolvimento de novos agentes antifúngicos são um dos principais alvos da indústria farmacêutica na atualidade. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar uma série de 12 compostos derivados de selenocianatos alílicos (SA) sobre quatro espécies de Candida (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei). Para tanto, foram determinadas as concentrações inibitória e fungicida mínima (CIM/CFM), os possíveis mecanismos de ação envolvidos e a cinética da ação destes SA. Paralelamente, foi também investigado o perfil de toxicidade das moléculas selecionadas. As moléculas de SA mostraram-se ativas sobre todas as cepas de Candida testadas. A CIM sobre as cepas alcançou atividade na ordem de nanogramas por mililitro e a CFM foi equivalente a CIM em 50% das cepas fúngicas avaliadas. Não foi constatada ação sobre a parede celular ou membrana citoplasmática fúngica, o que pode indicar uma classe de antifúngico com um diferente mecanismo de ação dos convencionais antifúngicos disponíveis na clínica médica. O perfil de toxicidade mostra que grande parte dos SA testados não exercem efeitos genotóxicos e citotóxicos sobre leucócitos humanos, além de ausência de alergenicidade. A cinética de ação demonstrou que SA 9 possui um efeito fungistático sobre as células fúngicas. Com base nos resultados encontrados neste estudo, podemos concluir que os SA são potenciais hits para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos no combate das mais prevalentes espécies de Candida, sendo o composto 9 a entidade com melhor atividade inibitória em baixas concentrações, segurança toxicológica e bom perfil de biodisponibilidade.Candida species are typical agents of opportunistic infections from low to high complexity. In the hospital environment, for example, they are usually related to systemic infections in immunocompromised patients with high mortality rates. Complexing this scenario, the indiscriminate use of antifungals has in recent years resulted in high levels of resistance, which currently hinders the success of therapeutic strategies. In view of this panorama, studies dedicated to the development of new antifungal agents are one of the main targets of the pharmaceutical industry today. In this sense, the main objective of this work was to evaluate a series of 12 compounds derived from allylic selenocyanates (AS) on four Candida species (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis and C. krusei). Therefore, the minimum inhibitory and fungicidal concentrations (MIC / MFC), the possible mechanisms of action involved and the kinetics of the action of these SA were determined. In parallel, the toxicity profile of the selected molecules was also investigated. AS molecules were active to all tested Candida strains. The MIC of the strains reached activity in the order of nanograms per milliliter and the CFM was equivalent to MIC in 50% of the evaluated fungal strains. No action was observed on the cell wall or fungal cytoplasmic membrane, which may indicate a class of antifungal with a different mechanism of action of the conventional antifungal available in the medical clinic. The toxicity profile show that a large part of the AS tested does not exert genotoxic and cytotoxic effects on human leukocytes, besides absence of allergenicity. The kinetics of action demonstrated that AS 9 has a fungistatic effect on fungal cells. Based on the results found in this study, we can conclude that AS are potential hits for the development of new antifungal agents in the fight against the most prevalent species of Candida, with compound 9 being the entity with the best inhibitory activity in low concentrations, toxicological safety and good bioavailability profile

From cultivation to new therapeutic strategies : statistical optimization of culture media and susceptibility associated with the search for new molecules and combinations to combat pulmonary mycoses

As micoses pulmonares apresentam sintomas inespecíficos ou são até mesmo assintomáticas, o que impacta no diagnóstico precoce e consequentemente no início da terapia para um bom prognóstico. Pacientes imunodeprimidos são os mais acometidos, nesses indivíduos as taxas de letalidade são altas e o tratamento é prolongado. Aspergillus e Cryptococcus estão entre os gêneros mais isolados em infecções pulmonares. Poucas opções terapêuticas estão disponíveis para Cryptococcus spp., e casos crescentes de resistência são observados para Aspergillus spp. mostrando a necessidade da busca por novas alternativas terapêuticas. É importante ressaltar que a taxa de crescimento e outras características de crescimento podem variar amplamente entre diferentes espécies de leveduras, incluindo as do gênero Cryptococcus e Candida. Essas diferenças podem ter implicações significativas na detecção e tratamento de infecções fúngicas. Esse fato impacta diretamente nos métodos de avaliação de suscetibilidade, crescimento em meios sólidos, entre outras metodologias, sendo necessário a busca pelo pleno crescimento durante ensaios biológicos. Como novas alternativas terapêuticas, esse trabalho avaliou o desempenho de derivados quinolínicos sobre espécies de Aspergillus e Cryptococcus. Para Cryptococcus, os derivados mostraram uma ótima atividade, com concentrações inibitórias mínimas (CIM) de ≤ 2 μg/mL, entre eles, os mais ativos foram clioquinol (CQ) e PH153. Os mecanismos de ação revelam que estes compostos não se ligam ao ergosterol presente na membrana celular fúngica. Entretanto, a presença de 0,8 M de sorbitol influenciou na atividade dos compostos, que por terem características quelantes de metais podem estar retardando o desbalanço osmótico da célula. Em consequência a esse provável mecanismo também foi observada a inibição da síntese de melanina, dependente de metais e um importante fator de virulência. Os testes de curvas de morte, bem como a concentração fungicida mínima (CFM) corroboram o provável mecanismo de ação, uma vez que seu comportamento é fungistático, ocorrendo a morte das leveduras por inanição. No caso de Aspergillus spp. os derivados também apresentaram atividade, porém a melhor CIM foi obtida com o CQ. Combinações binárias e ternárias foram realizadas utilizando CQ, anfotericina B (AFB) e itraconazol (ITZ). Misturas de fármacos que apresentaram 14 sinergismo significativo, como a combinação de CQ+ITZ e AFB+ITZ, permitiram reduzir as concentrações necessárias em mais de seis vezes em relação às CIM dos fármacos quando usados individualmente. Combinações também foram exploradas para espécies de Cryptococcus utilizando CQ, AFB, fluconazol (FLZ) e 8-hidroxiquinolina (8HQ). A combinação que obteve o melhor sinergismo foi observada entre FLZ na presença de CQ ou 8HQ, resultando um escore de sinergismo três vezes superior aos encontrado para FLZ+AFB, utilizados no tratamento da criptococose com doses diárias de 400-800 mg e 0,5-1 mg/kg, respectivamente, por dia. A concentração de FLZ foi reduzida de aproximadamente 4 μg/mL (50% de inibição) para 0,125 μg/mL na presença de CQ, inibindo mais de 90% do crescimento fúngico. Além disso, a combinação de FLZ+CQ inibiu a produção de melanina, não apresentou toxicidade aguda em modelo in vivo alternativo utilizando larvas de Tenebrio molitor, e ausência de irritabilidade nas concentrações testadas constatada através da metodologia de HET-CAM (membrana corioalantóica embrionária de ovos de galinhas). As combinações realizadas, bem como o uso dos derivados sozinhos apresentaram boas estratégias terapêuticas a serem exploradas para o tratamento da aspergilose e criptococose. Embora Aspergillus apresente uma condição de crescimento abundante e relativamente rápido, Cryptococcus por ser uma levedura apresenta um crescimento sub-ótimo. O estudo realizado através da comparação de métodos de fabricação do meio de cultivo sólido ágar sabouraud dextrose (ASD) mostra que a autoclavagem influencia diretamente no crescimento de Cryptococcus em ASD. O tempo prolongado de exposição a altas temperaturas de ASD provoca a degradação de nutrientes, bem como o acúmulo de produtos dessa degradação podem exercer um efeito antimicrobiano. Em meio de cultivo líquido, Cryptococcus apresentou melhor crescimento em meio RPMI na presença de 0,0330 M de MOPS, pH 5,5, 2% de glicose e inóculo de aproximadamente 8 x 104 permitindo também a melhor determinação das CIMs para AFB e FLZ. As modificações estudadas neste meio de cultivo representam uma alternativa interessante para a melhor determinação das CIMs e, consequentemente, a geração de pontos de corte clínico para outros antifúngicos.Pulmonary mycoses have nonspecific symptoms or are even asymptomatic, which impacts early diagnosis and consequently initiation of therapy for a good prognosis. Immunosuppressed patients are the most affected, in these individuals the mortality rates are high and the treatment is prolonged. Aspergillus and Cryptococcus are among the most isolated genera in pulmonary infections. Few therapeutic options are available for Cryptococcus spp., and increasing cases of resistance are observed for Aspergillus spp. showing the need to search for new therapeutic alternatives. Importantly, growth rate and other growth characteristics can vary widely between different yeast species, including those of the Cryptococcus and Candida genera. These differences can have significant implications for the detection and treatment of fungal infections. This fact has a direct impact on the methods of evaluating susceptibility, and growth in solid media, among other methodologies, requiring the search for full growth during biological assays. As new therapeutic alternatives, this work evaluated the performance of quinolinic derivatives on Aspergillus and Cryptococcus species. For Cryptococcus spp., the derivatives showed excellent activity, with minimum inhibitory concentrations (MIC) of ≤ 2 μg.mL-1, among them, the most active were clioquinol (CQ) and PH153. The mechanisms of action reveal that these compounds do not bind to the ergosterol present in the fungal cell membrane. However, the presence of 0.8 M of sorbitol influenced the activity of the compounds, which, due to their metal chelating characteristics, may be delaying the osmotic imbalance of the cell. As a result of this probable mechanism, inhibition of melanin synthesis, which is metal-dependent and an important virulence factor, was also observed. The death curve tests, as well as the minimum fungicidal concentration (MFC), corroborate the probable mechanism of action, since its behavior is fungistatic, with the death of yeasts due to starvation. In the case of Aspergillus spp. derivatives also showed activity, but the best MIC was obtained with CQ. Binary and ternary combinations were performed using CQ, amphotericin B (AMB), and itraconazole (ITZ). Mixtures of 16 drugs that showed significant synergism, such as the combination of CQ+ITZ and AMB+ITZ, allowed for a reduction of the necessary concentrations by more than six-times concerning the MIC of the drugs when used individually. Combinations were also explored for Cryptococcus species using CQ, AMB, fluconazole (FLZ), and 8-hydroxyquinoline (8HQ). The combination that obtained the best synergism was observed between FLZ in the presence of CQ or 8HQ, resulting in a synergism score three times higher than those found for FLZ+AMB, used in the treatment of cryptococcosis with daily doses of 400-800 mg and 0.5 -1 mg/kg, respectively, per day. FLZ concentration was reduced from approximately 4 μg.mL-1 (50% inhibition) to 0.125 μg.mL-1 in the presence of CQ, inhibiting more than 90% of fungal growth. In addition, the combination of FLZ+CQ inhibited melanin production, did not show acute toxicity in an alternative in vivo model using Tenebrio molitor larvae, and lack of irritability at the tested concentrations verified through the methodology of HET-CAM (embryonic chorioallantoic membrane of chicken eggs). The combinations performed, as well as the use of the derivatives alone, presented good therapeutic strategies to be explored for the treatment of aspergillosis and cryptococcosis. Although Aspergillus spp. presents an abundant and relatively fast growth condition, Cryptococcus spp., being a yeast, presents a sub-optimal growth. The study carried out through the comparison of manufacturing methods of solid culture medium Sabouraud dextrose agar (SDA) shows that autoclaving directly influences the growth of Cryptococcus in SDA. The prolonged time of exposure to high temperatures of SDA causes the degradation of nutrients, as well as the accumulation of products of this degradation that can exert an antimicrobial effect. In liquid culture medium, Cryptococcus grew better in RPMI medium in the presence of 0.0330 M MOPS, pH 5.5, 2% glucose, and approximately 8 x 104 inoculum, also allowing better determination of MICs for AMB and FLZ. The modifications studied in this culture medium represent an interesting alternative for better determination of MICs and, consequently, the generation of clinical cutoff points for other antifungals

Antifungal potential of alilic selenocyanate derivatives on pathogenic Candida species

Espécies de Candida são típicos agentes de infecções oportunistas de baixa a alta complexidade. No ambiente hospitalar, por exemplo, estão geralmente relacionadas a infecções sistêmicas em pacientes imunocomprometidos com altas taxas de mortalidade. Complexando esse cenário, o uso indiscriminado de antifúngicos acarretou nos últimos anos em altos índices de resistência, o que atualmente dificulta o êxito das estratégias terapêuticas. Em vista deste panorama, estudos empenhados no desenvolvimento de novos agentes antifúngicos são um dos principais alvos da indústria farmacêutica na atualidade. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar uma série de 12 compostos derivados de selenocianatos alílicos (SA) sobre quatro espécies de Candida (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei). Para tanto, foram determinadas as concentrações inibitória e fungicida mínima (CIM/CFM), os possíveis mecanismos de ação envolvidos e a cinética da ação destes SA. Paralelamente, foi também investigado o perfil de toxicidade das moléculas selecionadas. As moléculas de SA mostraram-se ativas sobre todas as cepas de Candida testadas. A CIM sobre as cepas alcançou atividade na ordem de nanogramas por mililitro e a CFM foi equivalente a CIM em 50% das cepas fúngicas avaliadas. Não foi constatada ação sobre a parede celular ou membrana citoplasmática fúngica, o que pode indicar uma classe de antifúngico com um diferente mecanismo de ação dos convencionais antifúngicos disponíveis na clínica médica. O perfil de toxicidade mostra que grande parte dos SA testados não exercem efeitos genotóxicos e citotóxicos sobre leucócitos humanos, além de ausência de alergenicidade. A cinética de ação demonstrou que SA 9 possui um efeito fungistático sobre as células fúngicas. Com base nos resultados encontrados neste estudo, podemos concluir que os SA são potenciais hits para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos no combate das mais prevalentes espécies de Candida, sendo o composto 9 a entidade com melhor atividade inibitória em baixas concentrações, segurança toxicológica e bom perfil de biodisponibilidade.Candida species are typical agents of opportunistic infections from low to high complexity. In the hospital environment, for example, they are usually related to systemic infections in immunocompromised patients with high mortality rates. Complexing this scenario, the indiscriminate use of antifungals has in recent years resulted in high levels of resistance, which currently hinders the success of therapeutic strategies. In view of this panorama, studies dedicated to the development of new antifungal agents are one of the main targets of the pharmaceutical industry today. In this sense, the main objective of this work was to evaluate a series of 12 compounds derived from allylic selenocyanates (AS) on four Candida species (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis and C. krusei). Therefore, the minimum inhibitory and fungicidal concentrations (MIC / MFC), the possible mechanisms of action involved and the kinetics of the action of these SA were determined. In parallel, the toxicity profile of the selected molecules was also investigated. AS molecules were active to all tested Candida strains. The MIC of the strains reached activity in the order of nanograms per milliliter and the CFM was equivalent to MIC in 50% of the evaluated fungal strains. No action was observed on the cell wall or fungal cytoplasmic membrane, which may indicate a class of antifungal with a different mechanism of action of the conventional antifungal available in the medical clinic. The toxicity profile show that a large part of the AS tested does not exert genotoxic and cytotoxic effects on human leukocytes, besides absence of allergenicity. The kinetics of action demonstrated that AS 9 has a fungistatic effect on fungal cells. Based on the results found in this study, we can conclude that AS are potential hits for the development of new antifungal agents in the fight against the most prevalent species of Candida, with compound 9 being the entity with the best inhibitory activity in low concentrations, toxicological safety and good bioavailability profile