Very Rare Complementation between Mitochondria Carrying Different Mitochondrial DNA Mutations Points to Intrinsic Genetic Autonomy of the Organelles in Cultured Human Cells

In the present work, a large scale investigation was done regarding the capacity of cultured human cell lines (carrying in homoplasmic form either the mitochondrial tRNALys A8344G mutation associated with the myoclonic epilepsy and ragged red fiber (MERRF) encephalomyopathy or a frameshift mutation, isolated in vitro, in the gene for the ND4 subunit of NADH dehydrogenase) to undergo transcomplementation of their recessive mitochondrial DNA (mtDNA) mutations after cell fusion. The presence of appropriate nuclear drug resistance markers in the two cell lines allowed measurements of the frequency of cell fusion in glucose-containing medium, non-selective for respiratory capacity, whereas the frequency of transcomplementation of the two mtDNA mutations was determined by growing the same cell fusion mixture in galactose-containing medium, selective for respiratory competence. Transcomplementation of the two mutations was revealed by the re-establishment of normal mitochondrial protein synthesis and respiratory activity and by the relative rates synthesis of two isoforms of the ND3 subunit of NADH dehydrogenase. The results of several experiments showed a cell fusion frequency between 1.4 and 3.4% and an absolute transcomplementation frequency that varied between 1.2 × 10^-5 and 5.5 × 10^-4. Thus, only 0.3-1.6% of the fusion products exhibited transcomplementation of the two mutations. These rare transcomplementing clones were very sluggish in developing, grew very slowly thereafter, and showed a substantial rate of cell death (22-28%). The present results strongly support the conclusion that the capacity of mitochondria to fuse and mix their contents is not a general intrinsic property of these organelles in mammalian cells, although it may become activated in some developmental or physiological situations

Oxidative phosphorylation system and cell culture media

Traditional culture media do not re-semble the metabolic compositionof human blood. The concentrationof different metabolites in thesemedia influences mitochondrialbiogenesis and oxidative phos-phorylation (OXPHOS) function.This knowledge is essential for theinterpretation of results obtainedfrom cellular models used for thestudy of OXPHOS function

Estrategia de terapia génica para el tratamiento de la Hepatoencefalopatía COXPD1

La Hepatoencefalopatía por deficiencia combinada de fosforilación oxidativa tipo 1 (COXPD1) es una enfermedad mitocondrial causada por una mutación en el gen GFM1 que codifica para el factor de elongación G1 (EFG1). Se trata de un factor de esencial para la síntesis de proteínas mitocondriales. Así, defectos en el mismo pueden desencadenar un trastorno multisistémico, de inicio precoz, que generalmente provoca la muerte de los pacientes en los primeros meses/años de vida, y dificulta el estudio de la enfermedad y consecuentemente su tratamiento. Es por ello que en los últimos años la investigación se ha dedicado al desarrollo de modelos animales de COXPD1 que reproduzcan el fenotipo de los pacientes. La generación de ratones Wt (Gfm1+/+), Ki (Gfm1R671C/R671C) y Ki/K0 (Gfm1R671c/-) ha sentado las bases para el inicio de nuevos ensayos de terapia génica. Por lo tanto, el presente estudio busca desarrollar una estrategia basada en la edición de genes con el sistema CRISPR/Ca9, que permita la corrección eficiente de la mutación c.2011C>T por su amplia presencia en pacientes y su relación con una mayor supervivencia. Requiriendo una extensa etapa de caracterización del fenotipo de los fibroblastos embrionarios obtenidos de los ratones modelo, seguido de un estudio exhaustivo de las mejores condiciones de diseño CRISPR y las condiciones de manipulación más adecuadas para la línea celular diana, y finalizando con la puesta a punto de protocolos apropiados. También fue posible caracterizar las necesidades metabólicas en presencia de la mutación R671C, desarrollar una estrategia de selección basada en la competencia celular para facilitar el aislamiento de los clones después de la edición, e incluso determinar comportamientos de respuesta adaptativa llamativos.<br /

Patología mitocondrial debida a mutaciones del gen FARS2. Patogenicidad de una nueva mutación.

La secuenciación del exoma ha resultado ser una herramienta muy importante para el diagnóstico de enfermedades de base genética en la infancia. El objetivo de este trabajo es analizar los pacientes descritos en la literatura con mutaciones patológicas en FARS2 (que codifica la Fenilalanil-ARNt sintetasa mitocondrial) y compararlos con un nuevo paciente diagnosticado recientemente en España con una mutación en este gen. Este paciente presenta una mutación puntual c.1256G>A (p.Arg419His) y una deleción del exón 3 en FARS2. Cinco de los siete pacientes conocidos diagnosticados de esta mutación tienen unas características clínicas compatibles con el Síndrome de Alpers, otro de ellos tiene una Paraplejía espástica hereditaria, mientras que la clínica de nuestro paciente es compatible con el Síndrome de Leigh. Las diferencias clínicas entre pacientes con una mutación en el mismo gen pueden deberse entre otras causas a la diferente localización de la mutación dentro de ese gen, afectando en cada caso a aminoácidos diferentes. Esto va a influir también en la edad de supervivencia de cada paciente. En tres de los trabajos que se han revisado se demostraba mediante estudios funcionales la relación entre la mutación que describen en FARS2 y la alteración de la función de la Fenilalanil-ARNt sintetasa lo que lleva a una disminución en general de la capacidad de carga del ARNt. Este estudio informa de una nueva mutación patológica en FARS2 a la vez que establece una nueva causa genética nuclear del Sindrome de Leigh

Comparación de fenotipos de pacientes con mutaciones en FBXL4

FBXL4 es un gen situado en el DNA nuclear, en el cromosoma 6q16.1. Este gen codifica un miembro de la familia de las proteínas F-box, la cual forma parte de un complejo con un importante papel en la ubiquitinación dependiente de fosforilación. Hasta el momento se han descrito 31 mutaciones distintas en 36 familias diferentes, entre ellas 19 de cambio de sentido, 6 de pérdida de sentido, 3 deleciones y 3 mutaciones en los sitios de corte y empalme (splicing) Las mutaciones patológicas encontradas hasta la fecha provocan un cuadro de encefalomiopatía de comienzo temprano, que se manifiesta con frecuencia desde el primer día de vida. A pesar de ser una entidad relativamente heterogénea, podemos cuadro clínico típico de un paciente con mutación de FBXL4 como un neonato de bajo peso al nacer que desde el comienzo presenta hipotonía, dificultad para la alimentación y rasgos dismórficos faciales, que analíticamente presenta una acidosis con un lactato muy elevado y en el que se realiza una RMN donde se detectan alteraciones de la señal en T2 junto a atrofia cerebral. No mejora a pesar de los tratamientos y con el paso del tiempo se constata un retraso del desarrollo En el presente trabajo, a partir de los informes clínicos de dos pacientes no publicados todavía que están siendo estudiados en el Grupo de Biogénesis y Patología Mitocondrial del Departamento de Bioquímica de la Facultad Ciencias de la Universidad de Zaragoza, se realiza una comparación entre estos pacientes y aquellos publicados en la literatura, al tiempo que se lleva a cabo una revisión bibliográfica acerca de todos los pacientes con mutaciones en FBXL4 publicados hasta la fecha. En los pacientes estudiados se han encontrado 3 mutaciones: dos de ellas de pérdida de sentido y una de alteración de corte y empalme que lleva a un cambio en la pauta de lectura. Presentan características fenotípicas habituales, como son el retraso del desarrollo, la elevación de ácido láctico en la analítica, o la depleción del mtDNA en la biopsia muscular, lo cual permite orientar el diagnóstico previamente al análisis genético

Estudio de patogenicidad de mutaciones en el gen CHCHD6

La membrana interna mitocondrial se organiza en estructuras denominadas crestas, que son importantes para el funcionamiento de la mitocondria. Los complejos de la cadena respiratoria I-IV y F1F0-ATP sintasa (CV) se localizan en las crestas y realizan el proceso de fosforilación oxidativa (OXPHOS) que produce ATP para la célula. El sistema MICOS (Sistema de contacto mitocondrial y organización de crestas) es importante en la formación y mantenimiento de las crestas. Se localiza en la zona de unión de crestas, que separa los dos dominios de la membrana interna: el dominio paralelo entre membranas y el dominio de crestas. El sistema MICOS se divide en dos subcomplejos: subcomplejo Mic60 y subcomplejo Mic10. Subunidades del sistema MICOS también se han relacionado con la estabilidad del mtDNA y con el importe de proteínas a la mitocondria. En el presente estudio se ha trabajado con fibroblastos derivados de un paciente al que, mediante secuenciación masiva, se le encontraron mutaciones en el gen CHCHD6/Mic25. CHCHD6/Mic25 es una proteína periférica de la membrana interna, orientada hacia el espacio intermembrana y forma parte del subcomplejo Mic60. Nuestros resultados indican que los fibroblastos con mutaciones en CHCHD6/Mic25 tienen niveles de ATP menores que el control y que poseen una estructura de crestas alterada. Los niveles de expresión de las demás proteínas del subcomplejo no cambian, aunque se observó un aumento de la expresión de subunidades del sistema OXPHOS. Se intentaron llevar a cabo estudios de complementación funcional, sin embargo, la sobreexpresión del gen resultó tóxica para las células. Bajos niveles de ATP mitocondrial y la alteración en las crestas indican que las mutaciones tienen efecto, sin embargo, es necesario modular la expresión del gen CHCHD6/Mic25 para confirmar la patogenicidad de las mutaciones en nuestro paciente.<br /

Nuevas mutaciones en POLG asociadas a epilepsia y retraso psicomotor.

Estudiamos el caso de una niña de 4 años con clínica compatible con posible enfermedad mitocondrial. En el estudio genético mitocondrial se descartan mutaciones y delecciones del DNA mitocondrial, por lo que se decide secuenciar el exoma, encontrando dos mutaciones nucleares, ambas recesivas, en el cromosoma 15. Las dos mutaciones afectan al gen que codifica para la POLG. La primera mutación p.A1217P no está descrita en la literatura, mientras que la segunda p.N864S está descrita únicamente en dos hermanas. Comparamos el informe de nuestra paciente con el de las dos hermanas y con un control p.Y955C, extraído de la literatura, en busca de similitudes en la herencia, clínica, histología, bioquímica y tratamiento de las tres entidades. Asimismo, estudiamos complementación funcional en fibroblastos en busca de la repercusión bioquímica de las dos mutaciones de nuestra paciente.<br /

Análisis de la tasa de traducción mitocondrial de fibroblastos embrionarios de ratón con hepatoencefalopatía COXPD1

La hepatoencefalopatía por deficiencia combinada de fosforilación oxidativa de tipo 1 (COXPD1) es una enfermedad mitocondrial causada por mutaciones en el gen GFM1 que codifica el factor de elongación mitocondrial G1 (EFG1). El estudio de diversos pacientes reveló una alteración en la secuencia de GFM1, un cambio de aminoácidos en la posición p.671 de Arginina a Citosina (p.R671C). Se generaron modelos permitieran estudiar la enfermedad, ratones portadores de la mutación p.R671C en homocigosis (Gfm1R671C/R671C). Sin embargo, su leve fenotipo condujo al intento fallido de obtener modelos knock-out para Gfm1, pero estos ratones sufrían letalidad embrionaria con el alelo en homocigosis. Como alternativa se generaron ratones heterocigotos con uno de sus alelos knock-out y otro con la mutación p.R671C (Gfm1-/R671C). Los fibroblastos de estas líneas de ratones se estudiaron en este trabajo. El análisis de los fibroblastos embrionarios ratón (MEFs) reveló niveles de EFG1 reducidos en la línea Gfm1-/R671C. Sin embargo, los niveles de EFG1 en la línea con un fenotipo más leve (Gfm1R671C/R671C) incrementaron ligeramente. Las dos líneas celulares con Gfm1mutado mostraron reducción en los niveles de COI, subunidad I del complejo IV o Citocromo c oxidasa de la cadena de fosforilación oxidativa. Esta expresión disminuida pudo observarse en el análisis mediante Western Blot e inmunocitoquímica. COI, proteína del sistema OXPHOS, es codificada por el DNA mitocondrial y sintetizada en los ribosomas mitocondriales, proceso en el que EFG1, factor de elongación tiene un papel fundamental. No se logró medir la tasa de traducción mitocondrial con la química click. Aunque se observó marcaje, es necesario optimizar el protocolo para las líneas celulares en estudio. <br /

Primer caso de enfermedad mitocondrial asociada a mutaciones puntuales en el gen ATAD3C

Las enfermedades mitocondriales suponen un conjunto de patologías caracterizadas por la alteración de los procesos de producción de energía. Estas pueden ser provocadas por mutaciones nucleares o por mutaciones en el propio material genético del orgánulo. Recientemente se ha descrito que la presencia de determinadas alteraciones en los genes del locus ATAD3 del cromosoma 1 puede ser causa de este tipo de afectaciones. Un único gen ATAD3 ha sido detectado en múltiples especies con un alto grado de conservación a lo largo de la evolución. En primates y humanos, este se ha duplicado dos veces en tándem dando lugar a un clúster formado por los genes ATAD3A, ATAD3B y ATAD3C.Las proteínas codificadas por los genes de este clúster pertenecen a la familia de las ATPasas asociadas a diversas actividades celulares o AAA-ATPasas. Al igual que ocurre en todas las proteínas de esta familia, se piensa que los monómeros de ATAD3 se unen formando hexámeros que, en este caso, se encontrarían anclados a la membrana interna mitocondrial. A pesar de que su función todavía no se ha definido, se cree que son fundamentales en los procesos de biogénesis y dinámica mitocondrial, en el mantenimiento de estructuras específicas del orgánulo y en la organización del DNA mitocondrial en torno a unas estructuras denominadas nucleoides. Del mismo modo, parecen fundamentales en la regulación del metabolismo lipídico.Desde el año 2016 se ha registrado un total de 50 pacientes que padecen enfermedades mitocondriales relacionadas con mutaciones en estos genes. El fenotipo de estos pacientes incluye alteraciones intrauterinas, retraso en el desarrollo psicomotor, sintomatología neurológica y afectación ocular y cardiaca. También es frecuente encontrar alteraciones del sistema nervioso central en pruebas de imagen así como niveles altos de lactato en la analítica sanguínea. En este trabajo presentamos al primer paciente diagnosticado de enfermedad mitocondrial relacionada con mutaciones puntuales en el gen ATAD3C. Al mismo tiempo realizamos una comparativa entre su fenotipo y el del resto de casos publicados teniendo en cuenta los distintos tipos de mutaciones encontradas.<br /

Oxidative phosphorylation inducers fight pathological angiogenesis

Pathological mutations in subunits of the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, or inhibitors of this biochemical pathway, increase the production of vascular endothelial growth factor (VEGF) and pathological angiogenesis. In many angiogenesis-related diseases, such as retinal, rheumatoid diseases, or cancer, OXPHOS dysfunction can be found. Thus, enhancing OXPHOS might be a promising therapeutic approach for pathologic angiogenesis