Efeito comparativo entre a angiotensina-(1-7) e o novo agonista do receptor MAS, CGEN 856S, nas vias AKT/eNOS e AKT/FOXO1 utilizando modelos celulares

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-14T01:02:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_aabp__versao_final.pdf: 1529132 bytes, checksum: 51bf23d86be80a9b2c67e4e2d34a7be6 (MD5) Previous issue date: 26Estudos em biotecnologia baseados em uma plataforma computacional desenvolvida pela empresa Compugen, Tel Aviv Israel permitiram a descoberta de um potencial agonista do receptor Mas, o CGEN 856S, o qual produz vários efeitos semelhantes àqueles produzidos pela Ang-(1-7), incluindo efeitos anti-hipertensivos e cardioprotetores, como diminuição de isquemia, redução de fibrose renal e cardíaca e vasodilatação dependente de óxido nítrico (NO). Além disso, o CGEN 856S é capaz de atenuar o remodelamento cardíaco induzido por isoproterenol e lesão por infarto do miocárdio. Estudos utilizando fosfoproteômica mostraram que a Ang-(1-7) promove ativação e translocação nuclear do fator de transcrição FOXO1 em células de endotélio de aorta humana (HAEC). No entanto, ainda não é claro se o CGEN 856S é capaz de ativar as mesmas vias de sinalização intracelular anteriormente já demonstradas para Ang-(1-7). Este trabalho avaliou e comparou os efeitos do CGEN 856S e da Ang-(1-7) sobre a ativação das vias AKT/eNOS e AKT/FOXO1, utilizando diferentes modelos celulares. Células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas com o receptor Mas (CHO-Mas) foram estimuladas com CGEN 856S e Ang-(1-7). Células CHO não transfectadas foram usadas como controle. O extrato proteico foi utilizado em Western Blot para detecção das proteínas AKT, AKT fosforilada, eNOS fosforilada, FOXO1 fosforilado, Mas e GAPDH. Células CHO-Mas e CHO foram expostas a ambos os peptídeos para medida da liberação de NO, através da técnica de incorporação de DAF-FM. Células HAEC, A549 e DU145 (as duas últimas, linhagens tumorais de câncer de pulmão humano e próstata humana, respectivamente) foram tratadas com CGEN 856S e Ang-(1-7) com ou sem tratamento prévio com A779, utilizadas para imunolocalização de FOXO1, analisadas por microscopia confocal e a intensidade de fluorescência nuclear foi quantificada. Células A549 e DU145 também foram utilizadas em teste de citotoxicidade, sendo tratadas com uma combinação dos inibidores de PI3K wortmannin ou LY294002 em diferentes concentrações e CGEN 856S ou Ang-(1-7). Os resultados mostraram uma diferença significativa no aumento da fosforilação da AKT, eNOS, bem como na desfosrorilação de FOXO1 apenas em células CHO-Mas tratadas com CGEN 856S e Ang-(1-7). Células CHO-Mas tratadas com ambos os peptídeos também promoveram um aumento significativo na liberação de NO comparado com células CHO-Mas não tratadas. Não foram observadas diferenças em células CHO não transfectadas. Células HAEC, A549 e DU145 tratadas com CGEN 856S e Ang-(1-7) promoveram translocação nuclear significativa de FOXO1. O A779 bloqueou este efeito, pelo menos, parcialmente. Tanto em células A549 quanto em DU145, a combinação dos inibidores de PI3K wortmannin e LY294002 com CGEN 856S e Ang-(1-7) mostrou um efeito anti-proliferativo potencializado. Estes dados sugerem que tanto o CGEN 856S quanto a Ang-(1-7), como agonistas do receptor Mas, possuem efeitos semelhantes e representam um potencial alvo terapêutico no câncer e em patologias cardiovasculares.Biotechnology studies based on a computational platform developed by Compugen, Tel Aviv, Israel - allowed the discovery of a potential Mas agonist, CGEN 856S, which produces several effects resembling those produced by Angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)], including anti-hypertensive and cardioprotective effects, such as decrease of ischemia, renal and cardiac fibrosis reduction and vasodilation nitric oxide (NO) dependent. Moreover, CGEN 8566S attenuates isoproterenol-induced cardiac remodeling and myocardial infarction injury. Studies using phosphoproteomics have shown that Ang-(1-7) promotes FOXO1 activation and nuclear translocation in human aortic endothelial cells (HAEC). It is not clear, however, whether CGEN 856S is capable to activate the same intracellular pathways than those previously demonstrated for Ang-(1-7). This study evaluated and compared the effect of CGEN 856S and Ang-(1-7) on AKT/eNOS and AKT/FOXO1 activation, using different cell types. Mas-transfected CHO (Chinese Hamster Ovary - CHO-Mas) cells were stimulated with CGEN 856S and Ang-(1-7). Non-transfected CHO cells were used as control. The protein extract was used for, AKT, phospho-AKT, phospho-eNOS, phospho-FOXO1, Mas and GAPDH detection by western blot. CHO-Mas and CHO cells were also exposed to both peptides for NO release measurement, through DAF-FM incorporation technique. HAEC, A549 and DU145 (human tumoral linages from lungs and prostate, respectively) cells were treated with CGEN 856S and Ang-(1-7) with or without previous A779 treatment. The cells were used for immunolocalization of FOXO1, analyzed by confocal microscope and the nuclear fluorescence intensity was quantified. A549 and DU145 cells were also used for cytotoxicity test, being treated with a combination of PI3 kinase inhibitors wortmannin or LY294002 in different concentrations and CGEN856S or Ang-(1-7). The results showed a significant increase phosphorylation of AKT, eNOS as well as the dephosphorylation of FOXO1 only in CHO-Mas cells treated with CGEN856S and Ang-(1-7). CHO-Mas transfect cells treated with CGEN 856S and Ang-(1-7) also promoted a significant release of NO compared with CHO-Mas non-treated cell. No differences were observed in CHO non-transfected cells. HAEC, A549 and DU145 cell types treated with CGEN 856S and Ang-(1-7) showed a significant FOXO1 nuclear translocation. A779 blocked this effect, at least partly. In both A549 and DU145 cells, the combination of the PI3 kinase inhibitors wortmannin and LY294002 with CGEN 856S or Ang-(1-7) showed a potentiated anti-proliferative effect. These data suggest that CGEN 856S and Ang-(1-7) as agonists of Mas receptor had similar effects, and thus represent a potential therapeutic target in cancer and cardiovascular pathologies