Desenvolvimento e validação de metodologia na detecção e quantificação de ocratoxina a no café verde e torrado utilizando cromatografia líquida acoplada aespectrometria de massas aplicando os conceitos da metrologia química

120 f. : il., tab.O café constitui uma matriz extremamente complexa e tem importante papel na economia mundial, especialmente nos países produtores e exportadores como o Brasil. No entanto tem sido alvo de barreiras técnicas devido a uma substância denominada ocratoxina A, micotoxina potencialmente nefrotóxica e nefrocarcinogênica encontrada em muitos alimentos inclusive o café. O presente trabalho tem como objetivo implantar os conceitos da metrologia química no desenvolvimento, e validação do método para identificação e quantificação de ocratoxina A no café verde e café torrado estimando a incerteza da medição e utilizando a técnica de Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas em série (CLAE-EM/EM) seguindo os critérios da diretiva EC-657/2002 e o documento orientativo do Inmetro (DOCCGCRE- 2010). A metodologia de extração baseou-se em Pittet (1998) e os parâmetros cromatográficos foram: fluxo de 0,3 mL/min, fase móvel 80:20 água ácido trifluoroacético 0,05%: metanol ácido trifluoroacético 0,05 %, volume de injeção de 50 PL, com o modo de injeção Full loop e sistema de eluição isocrático. A coluna utilizada foi Synergi Hydro C18. As condições do espectrômetro de massas foram otimizadas e a transição selecionada de acordo com suas energias de colisão foram m/z 404 >358 (-10,5 V) e m/z 404 >239 (-20,5 V). A partir da validação os métodos propostos foram considerados seletivos, a avaliação e comprovação do efeito matriz foi realizada através da comparação das variâncias e das médias através do teste F e teste t. O Fcalculado para o método café verde (25,2152) e café torrado (104,0353), apresentaram valores maiores que o Ftabelado (4,0426). O tcalculado para o café verde (5,0214) e torrado (10,1997) apresentaram valores superiores ao ttabelado (2,0106). Os métodos foram considerados lineares em toda a faixa de trabalho da curva de calibração com os coeficientes de determinação linear (r) de 0,98188 e 0,91754 para matriz café verde e café torrado, respectivamente. O limite de quantificação e detecção para os métodos propostos foram de 1,2 Pg/kg e 3,0 Pg/kg para café verde e 0,36 Pg/kg e 1,0 Pg/kg para café torrado. Os valores das recuperações médias, DPRr e DPRR variaram na faixa de 90,45 - 108,81 %, 5,39 - 9,94 % e 2,20 - 14,34 % para café verde; e de 89,02 - 108,85 %, de 2,43 - 13,73 % e 12,57 - 17,84 %, para café torrado. Todos os resultados obtidos encontram-se dentro dos limites comumente aceitáveis na literatura. Todos os resultados de medição e as incertezas expandidas (U) para ocratoxina A foram as frações mássicas W = (11,50 ± 1,11) Pg/kg e W = (4,63 ± 0,63) Pg/kg para café verde e café torrado, respectivamente. Os métodos desenvolvidos e validados utilizaram técnica de elevada sensibilidade, permitindo a detecção, confirmação e a quantificação de ocratoxina A no café verde e café torrado com cálculo da incerteza, podendo auxiliar futuramente na superação das barreiras técnicas para exportação do café brasileiro. ____________________________________________________________________________.ABSTRACT: Coffee is an extremely complex food matrix and has an important role in the world´s economy, especially in producing and exporting countries like Brazil. However this product may suffer from technical barriers imposed for exportation because of the possible presence of ochratoxin A, which is nefrotoxic and carcinogenic mycotoxin found in many foods including coffee. The aim of this study was to implement chemical metrology concepts in the development and validation of Liquid Chromatography with Mass Spectrometry in tandem (CLAE-EM/EM) method for identification and quantification of ochratoxin A in green and roasted coffee estimating uncertainty of measurement according to directive 2002/657/EC and Inmetro guidelines (DOC-CGCRE-2010). The extraction method was based on Pittet (1998) and chromatographic parameters were: flow rate of 0.3 mL/min, mobile phase 80:20 water trifluoracetic acid 0.05 %: methanol trifluoracetic acid 0.05 %, injection volume of 50 µL, injection mode Full loop, isocratic mode. The column was Synergi Hydro C18. The mass spectrometry parameters were optimized and transitions selected based on the colision energies monitored were m/z 404 >358 (-10.5 V) and m/z 404 >239 (-20.5 V). From the validation procedure, methods were considered seletive. The evaluation and verification of matrix effect was performed by comparing variances and averages using F and t test. Value of Fcalculated for green coffee (25.2152) and roasted coffee (104.0353), were higher than Ftable (4.0426). Value of t calculated for green (5.0214) and roasted coffee (10.1997) were higher than ttable (2.0106). Both methods were considered linear in the working range of calibration curve with linear correlation coefficients (r) of 0.98188 and 0.91754 for green and roasted coffee, respectively.The quantification and detection limits were 1.2 µg/kg and 3.0 µg/kg; 0.36 µg/kg and 1.0 µg/kg, for green and roasted coffee respectively. The average recoveries, RSDr and RSDR were in range of 90.45 – 108.81 %, 5.39 – 9.94 % and 2.20 – 14.34 % for green coffee and 89.02 – 108.85 %, 2.43 – 13.73 % and 12.57 – 17.84 % for roasted coffee. All results obtained were considered within acceptable levels according to literature. Measurement value and expanded uncertainties (U) for ochratoxin A were mass fraction w = (11.50 ± 1.11) and w = (4.63 ± 0.63) for green coffee and roasted coffee. Both methods developed and validated using a high sensitivity technique, that allowed detection, confirmation and quantification of ochratoxin A in green and roasted coffee with a estimated uncertainty of measurement, and in the future these methods can be used to help overcome possible technical barriers imposed for exportation of Brazilian coffee

Development and validation of a method for detection and quantification of ochratoxin A in green coffee using liquid chromatography coupled to mass spectrometry

A method using Liquid Chromatography Tanden Mass Spectrometry (LC-MS/MS) with matrix-matched calibration curve was developed and validated for determining ochratoxin A (OTA) in green coffee. Linearity was found between 3.0 and 23.0 ng.g-1. Mean recoveries ranged between 90.45% and 108.81%; the relative standard deviation under repeatability and intermediate precision conditions ranged from 5.39% to 9.94% and from 2.20% to 14.34%, respectively. The limits of detection and quantification were 1.2 ng.g-1 and 3.0 ng.g-¹, respectively. The method developed was suitable and contributed to the field of mycotoxin analysis, and it will be used for future production of the Certified Reference Material (CRM) for OTA in coffee

Determinação de colesterol por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas triplo quadrupolo

1 p. : il.O colesterol é uma substância essencial à célula animal e fluido corporal, sintetizado principalmente pelo fígado e córtex da supra renal, cujo excesso contribui para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, uma das principais causas de morte entre homens e mulheres no mundo. O aumento desta substância no organismo humano está diretamente relacionado aos hábitos alimentares, sedentarismo e metabolismo do indivíduo. A quantificação deste analito requer um alto nível de exatidão, sendo necessário para isto a validação do método analítico e a rastreabilidade ao mol através de materiais de referência certificados (MRC’s). Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma metodologia analítica para a determinação do colesterol através da cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas triplo quadrupolo (CLAE-EM/EM), a fim de fornecer confiabilidade e rastreabilidade nas medições de colesterol no Brasil

Material de referencia certificado: etanol en agua

10 f. : il.La certificación de un material de referencia se basa generalmente en normas internacionales de la serie ISO GUIA 30 a 35 y constituye básicamente tres etapas: la caracterización del material, la estimación de su homogeneidad y la estimación de su estabilidad, la cual debe establecer las condiciones de transporte y almacenaje del material. El presente articulo presenta el desarrollo del Material de Referencia Certificado de etanol en agua se origina en las determinaciones de la Resolución Inmetro n° 006 de 2002 que determina que todos los etilómetros utilizados en Brasil deben tener los modelos aprobados y las verificaciones iniciales, eventuales y periódicas realizadas, a partir de ensayos con soluciones de etanol en agua. Con la disponibilidad para la sociedad de este material de referencia certificado, el Inmetro contribuye con el proveer confiabilidad y trazabilidad a las mediciones,y con ello procurar brindar a la sociedad salud, seguridad y un medio ambiente libre de contaminación

Development and validation of a method for the analysis of ochratoxin a in roasted coffee

6 p. : il.A method using LC/ESI-MS/MS for the quantitative analysis of Ochratoxin A in roasted coffee was described. Linearity was demonstrated (r = 0.9175). The limits of detection and quantification were 1.0 and 3.0 ng g-1, respectively. Trueness, repeatability and intermediate precision values were 89.0-108.8%; 2.4-13.7%; 12.5-17.8%, respectively. To the best of our knowledge, this is the first report in which Ochratoxin A in roasted coffee is analysed by LC/ESI-MS/MS, contributing to the field of mycotoxin analysis, and it will be used for future production of Certified Reference Material

Comparison of High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector and with Tandem Mass Spectrometry methods for detection and quantification of Ochratoxin A in green and roasted coffee beans

Two analytical methods for the determination and confirmation of ochratoxin A (OTA) in green and roasted coffee samples were compared. Sample extraction and clean-up were based on liquid-liquid phase extraction and immunoaffinity column. The detection of OTA was carried out with the high performance liquid chromatography (HPLC) combined either with fluorescence detection (FLD), or positive electrospray ionization (ESI+) coupled with tandem mass spectrometry (MS-MS). The results obtained with the LC-ESI-MS/MS were specific and more sensitive, with the advantages in terms of unambiguous analyte identification, when compared with the HPLC-FLD

Proficiency testing for the determination of pesticides in mango pulp : a view of the employed chromatographic techniques and the evaluation of laboratories’ performance

7 p. : il.The proficiency testing for determination of pesticides residues in mango pulp was the third work of the partnership established by INMETRO and INCQS/Fiocruz. Three mango pulp samples were sent to each participant laboratory, two being spiked with the pesticides and one exempt of pesticides. The added pesticides were: deltamethrin, ethion, fenitrothion, malathion, and permethrin. The evaluation of the results of the homogeneity and the stability tests, as well as the determination of the assigned value was made in agreement with ISO GUIDE 35 and ISO 13528, assuming the samples were considered homogeneous and stable for the studied period. The assigned values and the standard deviation for proficiency evaluation was calculated using the robust algorithm, according to ISO 13528, and the evaluation of the results was carried through in accordance with ABNT ISO/IEC Guide 43-1. The z-score graphs and confidence ellipse was also used in the evaluation of the results. In the evaluation carried through from the values of the z-scores, 71% of the reported results were considered satisfactory based on the results found for this index. The evaluation of the analytical viability for the determination of each pesticide and of the analytical capacity of the participant laboratories was carried through. A summarized view of the chromatographic techniques and of preparation of sample used by the participant laboratories was also carried through in this work

Relatório final ensaio de proficiência para determinação de micotoxinas em alimentos 2ª rodada : matriz leite em pó

21 f.: il.Ensaio de proficiência (EP) é o uso de comparações interlaboratoriais com o objetivo de avaliar a habilidade de um laboratório em realizar um determinado ensaio ou medição de modo competente e demonstrar a confiabilidade dos resultados gerados. Em um contexto geral, o ensaio de proficiência propicia aos laboratórios participantes: avaliação do desempenho e monitoração contínua; evidência de obtenção de resultados confiáveis; identificação de problemas relacionados com a sistemática de ensaios; possibilidade de tomada de ações corretivas e/ou preventivas; avaliação da eficiência de controles internos; determinação das características de desempenho e validação de métodos e tecnologias; padronização das atividades frente ao mercado e reconhecimento de resultados de ensaios, em nível nacional e internacional. Com a crescente demanda por provas regulares e independentes de competência pelos organismos reguladores e clientes, o ensaio de proficiência é relevante para todos os laboratórios que testam a qualidade de produtos. Embora o número de provedores de ensaios de proficiência na área de alimentos seja grande, principalmente de provedores internacionais, os custos cobrados para a participação nestes ensaios são, normalmente, muito elevados, o que inviabiliza, em muitos casos, a participação de um laboratório em um número maior de ensaios. Uma avaliação dos níveis residuais de micotoxinas em produtos agrícolas é extremamente importante, pois pode ser um indicativo de que às boas práticas agrícolas não estejam sendo seguidas, permitindo a redução desses contaminantes químicos antes que estes afetem a saúde humana e animal causando graves perdas econômicas tanto na agricultura quanto na pecuária e mesmo até ao meio ambiente. Uma variedade de micotoxinas pode ser encontrada na maioria dos alimentos, em concentrações muito baixas (da ordem de mg/kg), portanto, a identificação e a quantificação destas substâncias nas diversas matrizes torna-se extremamente complexa. Não obstante, é crescente a exigência no mercado internacional quanto a níveis de resíduos de contaminantes em alimentos, cada vez mais reduzidos. Este relatório apresenta os resultados da avaliação de desempenho dos laboratórios participantes da segunda rodada do Ensaio de Proficiência promovido em parceria pela Diretoria de Metrologia Científica e Industrial (Dimci) do Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (Inmetro) e pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), para a determinação de micotoxinas em alimentos

Relatório final do ensaio de proficiência para determinação de micotoxinas em alimentos – 1ª rodada : matriz amendoim

Ensaio de proficiência (EP) é o uso de comparações interlaboratoriais com o objetivo de avaliar a habilidade de um laboratório em realizar um determinado ensaio ou medição de modo competente e demonstrar a confiabilidade dos resultados gerados. Em um contexto geral, o ensaio de proficiência propicia aos laboratórios participantes: avaliação do desempenho e monitoração contínua; evidência de obtenção de resultados confiáveis; identificação de problemas relacionados com a sistemática de ensaios; possibilidade de tomada de ações corretivas e/ou preventivas; avaliação da eficiência de controles internos; determinação das características de desempenho e validação de métodos e tecnologias; padronização das atividades frente ao mercado e reconhecimento de resultados de ensaios, em nível nacional e internacional. Com a crescente demanda por provas regulares e independentes de competência pelos organismos reguladores e clientes, o ensaio de proficiência é relevante para todos os laboratórios que testam a qualidade de produtos. Embora o número de provedores de ensaios de proficiência na área de alimentos seja grande, principalmente de provedores internacionais, os custos cobrados para a participação nestes ensaios são, normalmente, muito elevados, o que inviabiliza, em muitos casos, a participação de um laboratório em um número maior de ensaios. Micotoxinas são um grupo de substâncias formadas como metabólitos secundários de fungos, destacando-se a classe das chamadas aflatoxinas devido ao potencial tóxico e de contaminação de alimentos. Uma avaliação dos níveis residuais destas substâncias em produtos agrícolas é extremamente importante, pois pode ser um indicativo de que às boas práticas agrícolas não estejam sendo seguidas. Uma variedade de micotoxinas pode ser encontrada na maioria dos alimentos, em concentrações muito baixas (da ordem de mg/kg), portanto, a identificação e a quantificação destas substâncias nas diversas matrizes torna-se extremamente complexa. Não obstante, é crescente a exigência no mercado internacional quanto a níveis de resíduos de contaminantes em alimentos, cada vez mais reduzidos. No Brasil, os níveis de contaminação das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 são regulamentados em alimentos, incluindo amendoim. Este relatório apresenta os resultados da avaliação de desempenho dos laboratórios participantes da segunda rodada do Ensaio de Proficiência promovido em parceria pela Diretoria de Metrologia Científica e Industrial (Dimci) do Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (Inmetro) e pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), para a determinação de micotoxinas em alimentos