Identification and characterization of excretory/secretory proteins from Trichuris suis larvae

Zum Ende des 20. Jahrhunderts wurde die Hygiene-Hypothese formuliert, die besagt, dass in den Industrieländern der Rückgang parasitärer und bakterieller Erkrankungen das Risiko erhöht Allergien oder Autoimmunerkrankungen zu entwickeln. In der Zwischenzeit wurde die Th2-dominierte Immunantwort gegen parasitäre Helminthen erforscht und deren Modulation durch Effektormoleküle aufgeklärt. Proteine und andere Moleküle der Helminthen sind verantwortlich für eine veränderten Immunreaktion, die gleichzeitig unabhängige Entzündungen reduzieren können. Basierend auf den immunmodulatorischen Eigenschaften und der Hygiene-Hypothese wurde überlegt, Helminthen, wie den Schweinepeitschenwurm Trichuris suis (T. suis), zur Behandlung von Allergien und Autoimmunerkrankungen einzusetzen. In initialen klinischen Studien wurden verringerte Krankheitssymptome nach der T. suis ova (TSO) Therapie für Patienten mit Colitis ulcerosa und Morbus Crohn nachgewiesen. Jedoch zeigten einige Studien, dass die TSO Behandlung zwar keine schädlichen Nebenwirkungen für Patienten hat, aber auch keine klinisch relevanten Verbesserungen bringt. Daher wird die Erforschung der TSO-Therapie in relevanten Krankheitsmodellen immer wichtiger. Unsere Arbeitsgruppe hat im Vorfeld gezeigt, dass sekretorische (excretory/ secretory ES) Produkte von T. suis Larven potente Immunmodulatoren in einem Modell der allergischen Atemwegserkrankung sind. Des Weiteren wurde auch in Krankheitsmodellen für entzündliche Darmerkrankungen und Multiple Sklerose eine positive Immunmodulation durch T. suis ES nachgewiesen. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit, ES Proteine von T. suis Larven zu identifizieren, die möglicherweise unabhängige Immunantworten beeinflussen. Nach der rekombinanten Herstellung einzelner Proteine, sollten mögliche immunregulatorische Mechanismen aufgeklärt werden. Zu diesem Zweck wurden zehn potentielle Immunregulatoren im ES von T. suis L1 Larven ausgewählt. Von diesen wurden sechs Proteine rekombinant exprimiert und sowohl in vitro als auch in vivo getestet. In vitro Assays haben gezeigt, dass die LPS-induzierte Zytokinsekretion dendritischer Zellen (DCs) durch die Behandlung mit den rekombinanten Proteinen reduziert wird, wobei die Expression der DC-Oberflächenmarker nicht reguliert wurden. Von den 6 rekombinant exprimierten Proteinen milderte eines in vivo die allergische Atemwegserkrankung. Es wurde nicht nur die Eosinophilie in der Lunge und die Atemwegsresistenz reduziert, sondern sondern auch die Anzahl an interstitiellen Relm-alpha+ Lungenmakrophagen vermehrt. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass dieses Protein (TsES1) eine funktionell aktive Chitinase ist, die eine für Chitinasen typischen Struktur besitzt. Da auch Mäuse Chitinasen und Chitinase-like Proteine (CLPs) produzieren, überraschten die Beobachtungen der Immunregulation durch die Behandlung mit einer Helminthenchitinase. Untersuchungen zum Mechanismus haben ergeben, dass die TsES1-Behandlung kreuzreaktive Antikörper und regulatorische B-Zellen induziert und diese möglicherweise als regulatorische Faktoren wirken. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen neue Regulationswege auf, die einen Beitrag zur Erforschung der TSO-Therapie leisten. Obwohl TsES1 vermutlich kein guter Kandidat ist, können möglicherweise einzelne immunmodulatorische Proteine zukünftig eine Infektion mit lebenden Helminthen als Therapie von Allergien und Autoimmunerkrankungen ersetzen.At the end of the 20th century the hygiene hypothesis evolved, this suggested that the decrease of parasitic and bacterial infections in industrial countries increases the risk of developing allergies and autoimmune diseases. Meanwhile, the Th2 dominated immune responses elicited by helminth parasites have been investigated and their modulation by effector molecules was described. Proteins and other molecules of helminths are responsible for an altered immune reaction, that can concurrently suppress unrelated inflammation. Based on their immunomodulatory traits and the hygiene hypothesis, helminths like the whipworm Trichuris suis (T. suis) were considered as a treatment option for allergies and autoimmune diseases. Initial clinical trials demonstrated that patients suffering from Ulcerative colitis and Crohn’s disease experienced reduced disease symptoms after T. suis ova (TSO) therapy. However, in some studies TSO treatment had no adverse effects, but achieved also no clinically relevant improvements. Therefore, further investigation of TSO therapy in relevant disease models is of great importance. Our group has previously shown that excretory/secretory (ES) products of T. suis larvae are potent immunomodulators in an allergic airway hyperreactivity model. Furthermore, T. suis ES demonstrated beneficial immunomodulation in both gut inflammation and multiple sclerosis disease models. Hence, the aim of this work was to identify ES proteins of T. suis larvae, that might interfere with unrelated immune responses. After recombinant expression of single proteins, possible immunoregulatory mechanisms should be discovered. For that purpose, ten potential immunoregulators in the T. suis larval L1 ES were selected. Out of those, six proteins were recombinantly expressed and tested in vitro as well as in vivo. In vitro assays exhibit that LPS induced cytokine secretion of dendritic cells (DCs) was reduced by the treatment with recombinant TsES proteins, although the expression of DC surface markers were not regulated. One of the six recombinantly expressed proteins lowered the allergic airway lung inflammation in vivo. It not only decreased lung eosinophilia and airway resistance, but also led to increased levels of interstitial Relm-alpha + lung macrophages. Furthermore it was possible to show that this protein (TsES1) is a functional active chitinase with a typical chitinase structure. As chitinases and chitinase-like proteins (CLPs) are also produced in mice, the observed immunoregulation after the treatment with a helminth chitinase was astonishing. Mechanistic investigations revealed that TsES1 treatment induces cross reactive antibodies and regulatory B cells, that might act as regulatory factors. These results contribute to the research of TSO therapy, as new regulatory pathways were presented. Although TsES1 might not be a good candidate, single immunomodulatory proteins could act as a replacement to live helminth infection as a treatment for allergies and autoimmune diseases

A helminth chitinase structurally similar to mammalian chitinase displays immunomodulatory properties

Previously, we reported significant immunomodulatory effects of the entire excretory-secretory (ES) proteins of the first larval stage (L1) of the gastrointestinal nematode Trichuris suis in a rodent model of allergic hyperreactivity. In the present study, we aimed to identify the proteins accounting for the modulatory effects of the T. suis L1 ES proteins and thus studied selected components for their immunomodulatory efficacy in an OVA-induced allergic airway disease model. In particular, an enzymatically active T. suis chitinase mediated amelioration of airway hyperreactivity, primarily associated with suppression of eosinophil recruitment into the lung. The three-dimensional structure of the T. suis chitinase as determined by high-resolution X-ray crystallography revealed significant similarities to mouse acidic mammalian chitinase (AMCase). In addition, the unique ability of T. suis chitinase to form dimers, as well as acidic surface patches within the dimerization region may contribute to the formation of cross-reactive antibodies to the mouse homologs. This hypothesis is supported by the observation that T. suis chitinase treatment induced cross-reactive antibodies to mouse AMCase and chitinase-like protein BRP-39 in the AHR model. In conclusion, a biologically active T. suis chitinase exhibits immunomodulatory properties despite its structural similarity to the mammalian counterpart. Author summary: Experimental immunotherapy via reintroduction of intestinal worms to treat and prevent autoimmune, chronic inflammatory or allergic diseases is being discussed but the underlying mechanisms are still not fully understood. Here, we investigated the immunomodulatory potential of specific proteins of the whipworm Trichuris suis that are secreted very early during larval development. Using a murine model of allergic lung disease, we show that in particular one T. suis protein, functionally characterized as an active chitinase, is reducing the lung inflammation. The T. suis chitinases three-dimensional protein structure revealed remarkable similarities to the hosts’ chitinase, an enzyme known to play a pivotal role in lung allergy. We also show that treatment with the helminth chitinase induced cross-reactive antibody responses against murine chitinase and chitinase-like proteins, both being inflammatory marker and regulators of type 2 immunity. Thus, our study provides a novel mechanism of immunomodulation by helminth components and may contribute to a better understanding of clinical responses of patients receiving helminthic therapy