Aspergillus fumigatus C-faktor homológ génjének klónozása Streptomyces lividans 1326 törzsbe

Ahogy az imént tárgyaltakból kiderült sikerült klónoznom egy olyan 980 bp nagyságú rekombináns gént, amely ugyan eukarióta eredetű, de az E.coli DH5 alfa törzs restrikciós-modifikációs rendszer közreműködésének köszönhetően képes prokarióta szervezetekben is fennmaradni. Kezdeti lépésként PCR reakcióval amplifikáltuk Aspergillus fumigatus hármas kromoszómájának C faktor homológ génjét. A primereket úgy terveztük meg, hogy az előremutató primer 5’ végén SphI restrikciós enzim felismerő helyet, míg a hátramutató primer 3’ végén BglII restrikciós enzim felismerő helyet valamint hat darab histidin tag-et tartalmazzon. Az amplifikált restrikciós fragmenteket, valamint a pSP72 ampicillin rezisztencia gént hordozó E. coli vektorokat BglII-SphI RE-ekkel emésztettük, majd ligálási reakciót végeztünk. Az így kapott rekombináns plazmidokkal E. coli DH5 alfa törzseket transzformáltunk. Az ampicillin szelekciót követően a rezisztensnek bizonyult E. coli DH5 alfa törzsekből plazmidot izoláltunk és a megfelelő enzimes emésztést (BglII-SphI) követően sikerült elkülönítenünk Titusz és Leona nevű törzseket, akik tartalmazzák az eukarióta eredetű C faktor homológ géneket tartalmazó rekombináns plazmidokat. Ezt követően ezen plazmidokat tartalmazó transzformáns E. coli DH5 alfa törzseket 20%-os glicerinbe -70 oC-os kelvinátorba helyeztük megőrzésre. 22B