A defective Krab-domain zinc-finger transcription factor contributes to altered myogenesis in myotonic dystrophy type 1

Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is an RNA-mediated disorder caused by a non-coding CTG repeat expansion that, in particular, provokes functional alteration of CUG-binding proteins. As a consequence, several genes with misregulated alternative splicing have been linked to clinical symptoms. In our search for additional molecular mechanisms that would trigger functional defects in DM1, we took advantage of mutant gene-carrying human embryonic stem cell lines to identify differentially expressed genes. Among the different genes found to be misregulated by DM1 mutation, one strongly downregulated gene encodes a transcription factor, ZNF37A. In this paper, we show that this defect in expression, which derives from a loss of RNA stability, is controlled by the RNA-binding protein, CUGBP1, and is associated with impaired myogenesis—a functional defect reminiscent of that observed in DM1. Loss of the ZNF37A protein results in changes in the expression of the subunit α1 of the receptor for the interleukin 13. This suggests that the pathological molecular mechanisms linking ZNF37A and myogenesis may involve the signaling pathway that is known to promote myoblast recruitment during development and regeneratio

Epidermolyse bulleuse dystrophique (étude préclinique de thérapie génique et implication du collagène VII dans la tumorigénèse)

L'épidermolyse bulleuse dystrophique est une maladie génétique de la peau associée à des mutations dans le gène codant pour le collagène VII. Cette génodermatose est caractérisée par des décollements de la peau, des cicatrices mutilantes, et la survenue très fréquentes de carcinomes squameux invasifs. Cette maladie constitue un système très intéressant pour la mise en place d'une approche de thérapie génique cutanée et pour comprendre le rôle des composants de la membrane basale dans la cancérisation épithéliale. Nos résultats ont montrés que -1) des vecteurs rétroviraux contenant l'ADNc de 9kb du collagène VII transduisent efficacement des kératinocytes primaires de patients déficients en collagène VII. -2) les kératinocytes génétiquement modifiés sont utilisables pour générer des peaux reconstituées transplantables présentant in vivo toutes les caractéristiques histologiques et fonctionnelles d'une peau normale. L'identification et la caractérisation d'une famille de chiens EBDR exprimant un collagène VII muté nous a permis de valider l'approche de thérapie génique ex vivo des EBD dans un modèle animal immunocompétent. Grâce à la possibilité de réverser le phénotype EBD par transfert de l'ADNc du collagène VII nous avons lié le caractère invasif caractéristique des kératinocytes EBDR à une augmentation de l'expression des métalloprotéases MMP1 et MMP3 dans ces cellules. L'expression d'un collagène VII recombinant suffit à bloquer le pouvoir invasif des kératinocytes EBDR. Ces résultats prouvent pour la première fois que le collagène VII joue un rôle majeur de suppresseur d'invasion tumorale en régulant négativement l'expression des métalloprotéases MMP1 et MMP3.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Mise en place d'un épiderme reconstitué dérivé de cellules pluripotentes humaines pour la thérapie cellulaire et la modélisation pathologique

Ces travaux visaient à établir un protocole permettant de différencier des cellules pluripotentes (embryonnaires ou induites) en kératinocytes capables de générer un épiderme pluristratifié in vitro et in vivo pour la thérapie cellulaire et la modélisation pathologique. Dans une 1ère partie, des cellules hES ont été utilisées pour être différenciées en culture en kératinocytes. Ces cellules ont été caractérisées par des approches de RT-PCR quantitative, FACS et d immunofluorescence. De plus, leur potentiel immunogène a été évalué par l analyse en FACS des protéines du CMH de classe I et II. La capacité de ces kératinocytes à reformer un épiderme stratifié a été démontrée in vitro,sur une matrice synthétique, mais aussi in vivo après greffe sur souris immunodéficientes. Dans une 2ème partie, des cellules hIPS ont ensuite été dérivées en kératinocytes avec le même protocole. Si la caractérisation des kératinocytes issus des hIPS a produit des résultats positifs, la possibilité de maintenir ces cellules en culture s est révélée impossible dans les conditions utilisées. De même, alors que la stratégie visait à modéliser les épidermolyses bulleuses, l interférence avec l expression de protéines impliquées dans la jonction épidermo-dermique n a pas été couronnée de succès. Par contre, des nouvelles hIPS mutées ont pu être générées puis différenciées en kératinocytes, prouvant ainsi la possibilité d utiliser cette démarche pour modéliser la pathologie. Dans une 3ème partie, une étude d expression différentielle a permis de démontrer que les kératinocytes dérivés des cellules pluripotentes surexpriment la kératine 19 (marqueur foetal) par rapport à des kératinocytes postnataux.This work aimed to establish a protocol for the differention of pluripotent cells (embryonic or induced) into keratinocytes, which must be able to generate a pluristratified epidermis in vitro as well as in vivo for cell therapy and pathological modeling. In the 1st part of this work, a new protocol was developped to derive keratinocytes from hES cells. These cells were characterized by using RTq-PCR, FACS and immunofluorescence assays. Their immunogenicity was also evaluated by FACS analysis of class I and class II MHC proteins. The capacity of these keratinocytes to generate a pluristratified epidermis has been proved in vitro as well as in vivo following grafts onto immunodeficient mice. In a 2nd part of this work, hIPS cells were then derived into keratinocytes using the same protocol. The characterization of heratinocytes derived from hIPS produced positive results, but it was unfortunately not possible to maintain those cells in culture. Similarly, a strategy based on RNA interference against dermoepidermal junction proteins was not successful; but new hIPS mutated cell lines have been established and differentiated into keratinocytes, proving the feasibility of such an approach for pathological modeling. In a 3rd part of this work, a differential expression study proved that keratinocytes derived from pluripotent cells overexpress keratin 19 (marker fetus) when compared with postnatal keratinocytes.EVRY-Bib. électronique (912289901) / SudocSudocFranceF

Differentiation of nonhuman primate pluripotent stem cells into functional keratinocytes

Abstract Background Epidermal grafting using cells derived from pluripotent stem cells will change the face of this side of regenerative cutaneous medicine. To date, the safety of the graft would be the major unmet deal in order to implement long-term skin grafting. In this context, experiments on large animals appear unavoidable to assess this question and possible rejection. Cellular tools for large animal models should be constructed. Methods In this study, we generated monkey pluripotent stem cell-derived keratinocytes and evaluated their capacities to reconstruct an epidermis, in vitro as well as in vivo. Results Monkey pluripotent stem cells were differentiated efficiently into keratinocytes able to reconstruct fully epidermis presenting a low level of major histocompatibility complex class-I antigens, opening the way for autologous or allogeneic epidermal long-term grafting. Conclusions Functional keratinocytes generated from nonhuman primate embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells reproduce an in-vitro and in-vivo stratified epidermis. These monkey skin grafts will be considered to model autologous or allogeneic epidermal grafting using either embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells. This graft model will allow us to further investigate the safety, efficacy and immunogenicity of nonhuman primate PSC-derived epidermis in the perspective of human skin cell therapy

Human embryonic stem cells derivatives enable full reconstruction of the pluristratified epidermis.

Background: Cell therapy for large burns has successfully made use of autologous epidermis reconstructed in vitro for more than two decades. One limit to the efficacy of the current procedures is the need for a long lasting expansion of the patient's own keratinocytes. Immediate access to unlimited amounts of human epidermis may contribute to protect patients awaiting autologous grafts. The keratinocyte progeny of human embryonic stem cells is an interesting candidate for such a role, provided they are fully capable of reconstructing a pluristratified epidermis. Methods: Human embryonic stem cells were seeded on fibroblasts feeder cells during forty days in a medium supplemented with BMP4 (0.5 nM) and ascorbic acid (0.3 mM). A molecular characterization of cell differentiation was performed all along the process by quantitative-PCR, fluorescence activated cell sorting and immunocytochemical techniques. Keratinocyte molecular differentiation and functional capacity to construct a human epidermis were assessed in vitro and in vivo. Finding: Using a protocol that respected the chronobiology of epidermis formation during human ontogenesis, we have generated a homogenous population of cells exhibiting all phenotypic characteristics of basal keratinocytes from hESC. These cells readily constructed a pluristratified epidermis displaying normal human characteristics after seeding on an artificial matrix, and either secondarily grown in vitro or else transplanted in immunodeficient mice. Interpretation: Human embryonic stem cells can be coaxed to differentiate into basal keratinocytes that are fully functional, i.e. construct a pluristratified epidermis. This resource may be developed to provide temporary skin substitutes to patients awaiting autologous grafts

Human-Induced Pluripotent Stem Cell‒Derived Keratinocytes, a Useful Model to Identify and Explore the Pathological Phenotype of Epidermolysis Bullosa Simplex

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